Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen
Chapters
Summary March 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol voor genbewerking in primaire menselijke T-cellen met behulp van CRISPR Cas-technologie om CAR-T-cellen te wijzigen.
Transcript
Ons laboratoriumprotocol maakt de combinatie van menselijke genoombewerking met CAR T-celtherapie mogelijk. De laboratoriumprocedure is de aanpak met CRISPR-Cas9 om maximaal drie genen met een hoge efficiëntie te richten. En ten slotte kan onze aanpak worden vertaald naar klinische proeven bij mensen.
De beschreven methoden kunnen worden toegepast op andere CAR-constructen en doelgenen. De basis van de technieken is robuust genoeg om te worden vertaald naar grotere schaal en naar academische en industriële medewerkers voor verdere ontwikkeling. Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, beperk dan het aantal groepen in het gids-RNA-scherm om nauwkeurige incubatietijden mogelijk te maken.
Het naleven van de kweekomstandigheden en zaaidichtheid zoals beschreven zijn in onze ervaring van cruciaal belang gebleken. Om te beginnen, verkrijg autologe perifere bloed mononucleaire cellen, of PBMC's, van gezonde vrijwillige donoren en isoleer CD4- en CD8-positieve T-cellen met behulp van commercieel verkrijgbare CD4- en CD8-selectiekits. Combineer CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen in een één-op-één-verhouding en incubeer 3 miljoen cellen per milliliter in R10, aangevuld met 5 nanogram per milliliter van elke menselijke IL7 en menselijke IL15 's nachts bij 37 graden Celsius.
Tel de volgende dag de T-cellen en centrifugeer 5 tot 10 miljoen cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi alle supernatant weg en was de celkorrel in gereduceerd serum minimale essentiële media. Suspensie de pellet opnieuw in 100 microliter nucleaire affectie-oplossing volgens de instructies van de fabrikant.
Bereid tijdens het wassen van de cellen een ribonucleoproteïne of RNP-complex voor door 10 microgram Cas9-nuclease gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 5 microgram single guide RNA. Voeg een mock control toe zonder single guide RNA. Combineer de opnieuw gesuspendeerde cellen met het RNP-complex en voeg 4,2 microliter van vier micromolaire elektroporatieversterkers toe.
Meng goed en breng over in elektroporatie cuvetten. Elektroporateer de cellen met behulp van pulscode EH111, incubateer vervolgens 5 miljoen cellen per milliliter in R10, aangevuld met 5 nanogram per milliliter menselijk IL7 en menselijk IL15 bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur in 12 putplaten. Ga na de incubatie verder met T-celactivering en -expansie.
Ontwerp de sequencing primers door de volgorde van het PCR-amplicon in te voeren in een standaard primerontwerpsoftware. De ontwerpsoftware zal meerdere primersequenties voorstellen die geschikt zijn voor Sanger-sequencing. Kies voorwaartse en omgekeerde primers die met het amplicon ten minste 150 basenparen stroomopwaarts of stroomafwaarts van de gRNA-snijplaats binden om een goede sequencingkwaliteit rond de indels te garanderen.
Gebruik TIDE-analyse om knock-outefficiëntie op genomisch niveau te detecteren. Het algoritme reconstrueert nauwkeurig het spectrum van indels uit de sequentiesporen en berekent R-kwadraatwaarden. Na activering worden T-cellen uitgebreid in cultuur en gecryopreserveerd voor toekomstige studies.
Tijdens de uitbreiding worden de populatieverdubbeling en volumeveranderingen in het hele protocol bijgehouden voor zowel mock- als bewerkte CAR T-cellen. Er werden geen significante veranderingen gedetecteerd in de proliferatie en activering tijdens de uitbreiding. Zodra de cellen waren gecryopreserveerd, werden niveaus van CAR-expressie bepaald voor verdere functionele studies voor zowel de mock-bewerkte als knock-out CAR T-cellen.
Er werden geen significante veranderingen waargenomen. Knock-out efficiëntie kan worden bepaald met behulp van meerdere technieken. In deze representatieve flowcytometrieplots werden de PDCD1- en TRAC-loci gericht met behulp van single guide RNA, met een efficiëntie van 90% voor het PDCD1 single guide RNA en 98% voor het TRAC single guide RNA voor meerdere gezonde donoren.
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de molaire verhoudingen van Cas9 en geleideRNA's nauwkeurig zijn. Tijdens de procedure moeten de cellen altijd op vier graden Celsius worden gehouden en niet gedurende langere tijd in de elektroporatieoplossing worden achtergelaten. Na car-conservering kunnen de CRISPR-gemanipuleerde CAR T-cellen worden gebruikt voor in-vitro en in-vivo functionele assays, zoals cytotoxiciteitstests, cytokineproductie en syngenetische of xenografische tumormuismodellen.
Onze aanpak met CRISPR Cas9-technologie wordt nu toegepast op klinische onderzoeken. De aanpak kan zowel voor kanker worden gebruikt, als voor een niet-kwaadaardige genetische aandoeningen, zoals hemoglobinofaties, die miljoenen kinderen en volwassenen wereldwijd treffen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
