Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Produksjon av humane CRISPR-konstruerte CAR-T-celler

Imaging the Human Immunological Synapse

Journal (Immunology and Infection)

Imaging the Human Immunological Synapse

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Journal (Immunology and Infection)

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Click here for the English version

Produksjon av humane CRISPR-konstruerte CAR-T-celler

Article DOI: 10.3791/62299-v

March 15th, 2021 •

Sangya Agarwal*^1,2, Nils Wellhausen*^1,2, Bruce L. Levine^1,2, Carl H. June^1,2

¹Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 15th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Her presenterer vi en protokoll for genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjelp av CRISPR Cas Technology for å modifisere CAR-T-celler.

Transcript

Vår laboratorieprotokoll muliggjør kombinasjon av menneskelig genomredigering med CAR T celleterapi. Laboratorieprosedyren er tilnærmingen med CRISPR-Cas9 for å målrette mot opptil tre gener med høy effektivitet. Og til slutt er vår tilnærming i stand til å bli oversatt til menneskelige kliniske studier.

Metodene som beskrives kan brukes på andre CAR-konstruksjoner og målgener. Grunnlaget for teknikkene er robust nok til å bli oversatt til større skala og til akademiske og bransjepartnere for videreutvikling. Når du prøver denne protokollen for første gang, må du begrense antall grupper i guide RNA-skjermen for å muliggjøre nøyaktige inkubasjonstider.

Å følge kulturforholdene og såddtettheten som beskrevet har vist seg å være kritisk i vår erfaring. Til å begynne med, få autologe perifere mononukleære celler i blodet, eller PBMCer, fra friske frivillige givere og isoler CD4- og CD8-positive T-celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige CD4- og CD8-utvalgssett. Kombiner CD4-positive og CD8-positive T-celler i et en-til-en-forhold og inkuber 3 millioner celler per milliliter i R10, supplert med 5 nanogram per milliliter av hvert menneske IL7 og menneskelig IL15 over natten ved 37 grader Celsius.

Neste dag teller du T-cellene og sentrifugerer 5 til 10 millioner celler ved 300 ganger G i fem minutter. Kast alle supernatant og vask cellepelleten i redusert serum minimal essensielle medier. Re-suspendere pellet i 100 mikroliter av kjernefysisk hengivenhet løsning i henhold til produsentens instruksjoner.

Mens du vasker cellene, lag et ribonucleoprotein- eller RNP-kompleks ved å inkubere 10 mikrogram Cas9-kjernease med 5 mikrogram enkeltfører RNA i 10 minutter ved romtemperatur. Inkluder en spottekontroll uten RNA med én guide. Kombiner de re-suspenderte cellene med RNP-komplekset og tilsett 4,2 mikroliter fire mikromolarelektroporasjonsforsterker.

Bland godt og overfør til elektroporasjonspovetter. Elektroporate cellene ved hjelp av pulskode EH111, deretter inkubere 5 millioner celler per milliliter i R10, supplert med 5 nanogram per milliliter menneskelig IL7 og menneskelig IL15 ved 30 grader Celsius i 48 timer i 12 brønnplater. Etter inkubasjonen, fortsett med T-celleaktivering og utvidelse.

Design sekvensering primere ved å gå inn i sekvensen av PCR amplicon i en standard primer design programvare. Designprogramvaren vil foreslå flere primersekvenser som passer for Sanger-sekvensering. Velg fremover og bakover primere som binder seg til amplikon minst 150 basepar oppstrøms eller nedstrøms gRNA-kuttestedet for å sikre god sekvenseringskvalitet rundt indels.

Bruk TIDE-analyse for å oppdage knockout-effektivitet på genomisk nivå. Algoritmen rekonstruerer nøyaktig spekteret av indels fra sekvenssporene og beregner R-kvadratverdier. Etter aktivering utvides T-celler i kultur og kryopreserveres for fremtidige studier.

Under utvidelsen spores populasjonens dobling og volumendringer gjennom hele protokollen for både mock og redigerte CAR T-celler. Ingen vesentlige endringer ble oppdaget i spredning og aktivering under utvidelsen. Når cellene ble kryopreservert, ble nivåene av CAR-uttrykk bestemt for videre funksjonelle studier for både mock redigerte og knockout CAR T-celler.

Ingen vesentlige endringer ble observert. Knockout effektivitet kan bestemmes ved hjelp av flere teknikker. I disse representative flytcytometriplottene ble PDCD1- og TRAC-loci målrettet ved hjelp av enkeltguide RNA, som viste en effektivitet på 90% for PDCD1 enkeltguide RNA og 98% for TRAC single guide RNA på tvers av flere friske givere.

Det er viktig å sørge for at molarforholdene til Cas9 og guide RNAer er nøyaktige. Under prosedyren skal cellene alltid holdes ved fire grader Celsius og ikke bli igjen i elektroporasjonsløsningen i lengre perioder. Etter CAR-bevaring kan CRISPR-konstruerte CAR T-celler brukes til in-vitro og in-vivo funksjonelle analyser, for eksempel cytotoksisitetsanalyser, cytokinproduksjon og syngenetiske eller xenografiske tumormusmodeller.

Vår tilnærming ved hjelp av CRISPR Cas9-teknologi brukes nå på kliniske studier. Tilnærmingen kan brukes både til kreft, samt ikke-ondartede genetiske lidelser, som hemoglobinofiteter, som påvirker millioner av barn og voksne over hele verden.

X

Simple Hit Counter