Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection
Author Produced

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Journal (Immunology and Infection)

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Journal (Immunology and Infection)

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Click here for the English version

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Article DOI: 10.3791/62328-v

November 13th, 2021 •

Lichen Zhang¹, Rong Huang¹, Liaoxun Lu¹, Rui Fu¹, Guo Guo¹, Yanrong Gu¹, Zhuangzhuang Liu¹, Le He¹, Marie Malissen², Yinming Liang¹

¹The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 13th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokol bruger fluorescerende journalister og cellesortering til at forenkle knock-in eksperimenter i makrofag og T cellelinjer. To plasmider anvendes til disse forenklede knock-in eksperimenter, nemlig en CRISPR/Cas9- og DsRed2-udtrykke plasmid og en homolog rekombination donor plasmid udtrykke EBFP2, som er permanent integreret på Rosa26 græshoppe i immunceller.

Transcript

Målet med denne protokol er at forenkle CRISPR/Cas9 medieret knock-in eksperiment i makrofag og T-celle linjer, ved hjælp af fluorescerende reportere og påvirke celle sortering. ROSA26 Locus er kendt som et genomisk sikkert havnested til indsættelse af transgener. Det er en sædvanlig at udtrykke protein af interesse med eller uden angreb i musen verden af 26 græshoppe, eller i den menneskelige ortho log.

Del 1: Design og Plasmid Opførelse af sgRNAs Målretning Rosa26 Locus. Først design sgRNAs fra musen Rosa26 locus, ved hjælp af sekvenser fra mus genom informatik, og Ensemble Genome Browser, derefter downloade genomisk sekvens af musen Rosa26 genet. Gå til online web-værktøjet, CRISPOR, indsæt 100 basispar af inputsekvensen fra Rosa26 Locus.

Vælg derefter et genom, for eksempel Mus musculus-mouse reference genom 2011. Vælg derefter typen pam. Brug 20bp NGG"PAM-motiv, der genkendes af spCas9.

Klik på Send. Vælg guide med en høj specificitet score, høj gør score, og en færre off mål. Vejledninger, der er angivet som ineffektive, bør undgås.

Især foretrækkes det at vælge en to vejledninger med overlappende sekvenser, hvilket kan øge knock-in effektivitet som rapporteret. For varm spise sekvens, syntetisere en fremad ulovlig og en vending ulovlig, som annealed fosfor og klar til kloning til faktor. Forbered lineariseret fald pr Vactor, som kunne udtrykke er jeg nødt til at reporter af BBS en fordøjelse, ligesom få Neal, legals til lineariseret vektor til at generere den endelige konstruktion, som samtidig udtrykker guide RNA og CAS ni kerne forbundet med en DSRIP to fluorescerende reporter.

Anden del: Konstruktion af målretningsvektor som homolog rekombinationsskabelon. For udtryk for protein af interesse. For eksempel varede mennesket op.

Du ønsker syntetisere cDNA sekvens af kommercielle kilde og affinitet OST tag eller andre almindeligt anvendte angreb til rensning af protein kan smeltes til cDNA sekvens. Husk at inkludere den kasakiske konsensussekvens før indledningen af cDNA. Fordøjet af Asc1 begrænsning enzym, og gerne få cd'en og indsætte i rygraden.

Vactor, nemlig pKhR26-IBFP IBP giver den endelige målretning koncentrere beholderen, hver enkelt, KB af fem prime og tre prime homologe arme. Udtrykket stemmer sæt omfatter en CG promotor, UST restaurant, hvis du vil Koonin region knyttet til en Iris, hvis VFD reporter og en poly AC midler. Endelig i horisonten målretning vektor ved hjælp af unikke fræser enzymer, såsom EcoR1 eller BamH1, fordøjer og produkt er renset i en butik, der minus 20 grader på elektroporation noter.

Det anbefales at opnå høj koncentration af lineariseret vektor DNA. Del tre:Elektroporering af makrofag og T-celle linjer forberede cellekultur fulgte adskillelse for Geritalk celler. Optimal celletæthed var ca. 0,5 millioner celler pr. ML på tidspunktet for transfektion.

Fuld elektroporation i ti makro små nukleare mode tip formater forberede en 24 brønd plade, der indeholder 500 mikroliter af fuldstændig vækst, medium uden antibiotika i hver brønd. Forvarm pladerne i befugtet 37 grader, 5%dækker denne indstilling inkubator. Skru ned for det elektriske operativsystem input elektroporation parametre for jet kat eller Rosales.

Forbered celle DNA-blanding opfølgninger eller operation indsamle kylling celler. Curchin 25 kvadratcentimeter kolbe overførsel celler i de 15 dyr. Da du rør, så Phillip cellerne ved centrofugering på 90 gange G i otte minutter ved stuetemperatur, bede om det, supernatants.

Til vask skal cellerne resuspend cellerne med de fem ML PBS, og drej derefter celleaffjedringen ved centrifugering ved hjælp af samme tilstand som det foregående trin. Fjern DPP'erne. Og genbruge cellepuderne ved hjælp af to ML DBS.

Du forbliver mikro lille celle suspension og blandes med den samme mængde på 0,2% Trepan Ballou at estimere celletælling belastning prøve i form tælle slot indsætte Connie slide i den automatiserede celle Connor og se billedet selv. Så få et celletællingsresultat. Beregn 2 millioner celler vil finde ry for elektroporation per banke eksperiment overføre antallet af celler i 1,5 ML.Centrifuge to pellet celler ved centrifugalisering.

For at spare tid kan elektroporationsblandingen fremstilles under centrifugaliseringen, der tilføjer 2,5 mikrogram af hver af CRISPR CAS ni vektor 2,4 mikrogram Belinda ris, snakkesalig vektor og re suspension Buffalo. Vores samlede volumen på 55 makro kuld i en ny 1,5 ML centrifugeret rør forsigtigt knudepunkt og. Kort står til at blande godt.

Lad Luxor trykblandingen og rumtemperaturen stå før brug. Efter spinning aspart, DTB er denne væsentlige sikring i yderligere 30 sekunder, fjerne så meget supernatant som muligt re suspendere celler ved at tilføje den forberedte elektroporation blanding pipette op og ned forsigtigt. Elektroporation bedt om cellen elektroporation mixer ved hjælp af 10 mikro lille nukleare fraktion tip var pipetter vigtigt.

Undgå luftbobler under pi petting det vil koste elektroplating fiasko. Tryk på start. hvorefter operationen overfører prøven om et stykke tid.

Nå af 24, godt plader med en pre-advare brutto medium udføre det samme elektriske tryk og procedurer som ovenfor på de resterende fire replikerede prøver, forsigtigt rock pladen for at sikre jævn fordeling af cellerne. Inkuber cellerne i 37 graders inkubator i 48 til 72 timer. Før fakta, celle sortering På 24 timer efter transfection, undersøge udtrykket af forstyrre to for restaurant reporter ved hjælp af florescerende mikroskopi løsrevet fra rep for os selv viser, at elektroporation fungerer korrekt.

Del 4:cellesortering for at isolere putative knock-in-celler. Før celle sortering forberede, i 96 brønd plader med 150 mikro lidt af celletype specifikke brutto medium per godt bruge forkert bund mikro sted for kultur og sig selv og den flade bund mikro sted for alle celler overføre celler til en steril FACS at holde røret i på is og til at sætte kassen i stien gennem vinduet, tilslutning til cellesorteringsrum, når det er relevant, sæt cellesortering med 85 mikrometer dyse og lav strømningshastighed for immuncellesortering for at opnå optimal celleværdighed og overlevelse tage prøver fra pass-through vinduet knudepunkt kort, og indlæse prøven i opkøb. Champer oprettet fakta skøjteløb for celle sortering først defineret salg tragte for Ford scatter og side scatter, derefter definere livsceller ved at få sættet taler røde negative celler.

Dernæst finder de en levende enkelt celler ved enkelt singlet gating ved hjælp af FSC H versus FSE en multi-varieret blok. Sæt endelig en port til de ønskede DSR'er to og B, hvis Volvos positive delpopulation, som angiver, at cellerne med succes er blevet overført med CRISPR-vektor og lommevektoren. Så 10 enkeltceller i hver brønd af 96, godt plade suppleret med forvarm, den komplette vækst medium ved hjælp af periode mode eller enkelt celle mode efter sortering inkubere 96, godt plader i cellekultur inkubatoren for celle ekspansion.

Del fem:screening af højde af positive knock-in celler Efter ca. to ugers celleudvidelse forbi overleve, cellerne i 48 brøndpladen vurdere udtrykket af BFP eller flow cytometri ved hjælp af en lille andel af formere sig ved hjælp af vægtype celler som en negativ kontrol cellepopulationer, besidder højere procentdel af BFP positive celler holdes til at opfylde validering udtrække genomiske DNA fra de celler, vi bør udtrykke BFP passerer pcr'ets isolerede genomiske DNA med primere, der spænder over hver side af de homologe arme, nemlig en primær lokaliserer i den genomiske sekvens, udvendigt til målretningsvektoren. Den set side til at tale med vektoren i dette eksperiment, den forudsagte størrelsen af PCR produkt forstærket med den primære er 1,2 KV. Og med F to og R to er 1,2 KB Sanger sekventering resultater. Så PCR-produkter viser sekvenserne af hvert integrationskryds, der demonstrerer den korrekte og bankeposition i Rosa 26 Lucas.

Jeg siger ligesom immun blotting gør det muligt at validere korrekt banke på protein niveau del seks repræsentative resultater. Som et eksempel, offentliggjort i tidligere undersøgelse, vi gav udtryk for, at få 45 molekyler tack, at inter med en OSD-tag, og der var en 26 græshoppe i kassen T-celler efterfølgende USD takt. Jeg får 45 og hændelse direktører eller trukket ned af affinitet rensning og et emne for massespektrometri.

De proteomics data afslørede interaktion mellem T-celler. Derfor har denne produktpulje i høj grad lettet søgningen efter nye intercalatorer til at belyse funktionen af et givet protein. Denne tekniske præsentation viste, at ved forbigående udtrykt øget per støbt linje RFP med taler vektor co-udtrykt og BFP for Rosa 26 græshoppe.

Vi genererede banke cellelinjer med permanent genekspression i både T-celler og makrofager, som er vanskelige at udføre i genetiske manipulationer. Disse metoder og anbefalinger gælder for Chris tilladt i påstande om store DNA-segment for mekanistiske undersøgelser af immunceller, såsom til identifikation af protein, protein interaktion undersøgelse.

X

Simple Hit Counter