Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nano-differentialscanning fluormetri til screening i fragmentbaseret lead discovery
Chapters
Summary May 16th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Overvågning af ændringer i smeltetemperaturen af et målprotein (dvs.termisk skiftanalyse, TSA) er en effektiv metode til screening af fragmentbiblioteker af et par hundrede forbindelser. Vi præsenterer en TSA-protokol, der implementerer robotassisteret nanodifferenti differentialscanning af fluormetri (nano-DSF) til overvågning af iboende tryptofanlyscens og let rygspredning til fragmentscreening.
Transcript
Denne protokol er nyttig til kampagner for registrering af fragmenterede led som et ekstra værktøj til valg af lovende fragmenter som varmekandidater. Nano DSO til fragmentscreening bruger en begrænset mængde umærket proteinprøve og kan rutinemæssigt anvendes til næsten alle proteinmål. Denne metode kan bruges til at screene alle samlinger af ligands.
eller for at kontrollere varme fra de andre metoder. Tag en fragmentplade ud fra fryseren minus 20 eller minus 80 grader og lad den tø op ved stuetemperatur med blid rysten på en bænktop shaker. Centrifuge pladen på 500 gange G i 30 sekunder for at indsamle eventuelle dråber klæber til siden af brøndene.
Tag en MRC 2-brønd krystallisering plade og pipette 15 mikroliter af protein lageropløsningen i hver sub godt ved hjælp af en multi-kanal pipette. For at kontrollere fragment- og proteinpladedefinitioner på Mosquito skal du tænde nanodispenseren og sørge for, at der ikke er forhindringer omkring de bevægelige komponenter. Åbn den grafiske brugergrænseflade, klik på fanen Opsætning og under Dækkonfiguration kontrollere, om den type plade, hvor forbindelserne leveres, og den, hvor proteinet overføres, allerede findes på listen over tilgængelige plader.
Hvis ikke, skal du klikke på Indstillinger og derefter på Plader og oprette en ny pladedefinition ved at udfylde de korrekte værdier for egenskabstypen. Angiv pladepositionerne under Dækkonfiguration under fanen Opsætning. Brug rullemenuen til at vælge Grainier U bundplade til position et og MRC 2-brønds plade til position to og gemme protokollen.
Placer fragmentpladen på position et og proteinpladen på position to af dækket. Klik på Filer under protokolfanen, og vælg den protokol, der blev gemt i forrige trin til udlevering af fragmenterne. Definer mængden af de fragmenter, der skal udleveres, som 0,3 mikroliter.
For en typisk plade, hvor kolonne et og 12 ikke indeholder fragmenter, skal du definere startplaceringen til kolonne to og slutplaceringen til kolonne 11. Hvis kolonne to eller 11 er tomme i nogle plader, skal du bruge kolonne tre og 10 som start- og slutværdier. Klik på Kør for at starte programmet.
Når dispensering, som tager cirka to minutter er afsluttet, fjerne protein og fragment plader fra robotten og forsegle dem med en klæbende forsegling film. Kort centrifuge proteinpladen på 500 gange G i 30 sekunder for at indsamle enhver dråbe stikning til siderne brøndene, før du går videre til næste trin. Undersøg visuelt proteinpladens brønde for nedbør, der kunne have fundet sted på grund af tilsætning af fragmenter.
Hvis nedbør observeres i mange brønde, reducere koncentrationen af fragmenter og gentage eksperimentet. Tænd Prometheus-instrumentet. Tryk på Åbn skuffe på berøringsskærmen for at få adgang til instrumentets kapillærbelastningsmodul.
Fjern magnetstriben fra lastemodulet, og rengør spejlet med ethanol for at fjerne støvpartikler. For at overføre en opløsning fra proteinfragmenterpladen til kapillærerne skal proteinpladen og kapillærerne placeres ved siden af instrumentet for nem adgang til kapillærbelastningsmodulet. Tag den ene kapillær, der holder den i den ene ende, og rør ved opløsningen i proteinpladen med den anden ende af kapillæren for at overføre prøven.
Brug altid handsker og sørg for ikke at røre kapillæren i midten, da urenheder fra handskerne vil påvirke målingen. Placer kapillæren i holderens udpegede position, og sørg for, at den er korrekt justeret og centreret, gentag disse trin for at udfylde alle positioner i lastmodulet. I slutningen skal du placere magnetstriben oven på kapillærerne for at holde dem på plads og trykke på Luk skuffe for at starte Nano-DSF-eksperimentet.
Åbn Prometheus-program-PR. ThermControl og oprette et nyt projekt ved at klikke på Start ny session. Først skal du lave en opdagelsesscanning for at opdage eksescensen af prøverne. Ændre ekstenscerende signal af prøverne ved at justere excitation magt laseren.
For en termisk denaturering skal du klikke på fanen Smeltende scanning, indstille starttemperaturen til 20 grader Celsius, sluttemperaturen til 95 grader Celsius og temperaturskråningen til en grad Celsius pr. Minut. Klik derefter på Start måling. Frekvensfordelingen af skiftet og smeltetemperaturen for den ydre, kinetiske eller stærkt udtrykt i kræft et protein, regulatorisk tetratricopeptid gentag domæne af monopolar spindel kinase 1, og SARS-CoV-2 3c-lignende protease er vist her.
Negative værdier indikerer en reduktion i smeltetemperaturen i nærværelse af et fragment, mens en positiv værdi indikerer en stigning i smeltetemperaturen. For Nsp5 har alle fragmenter en de-stabiliserende effekt, mens der for Hec1 og Mps1 observeres både stabiliserende og destabiliserende hits. Dette er en billig og hurtig metode til at screene fragmentbiblioteker.
Andre metoder såsom NMR eller røntgenkrystallografi kan vise den nøjagtige binding af fragmenter, og de er også tilgængelige via INX-opdagelse. Resultaterne med coronavirus var med til at foreslå nye forbindelser, der kan udvikles til medicin mod covid-19.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
