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डेंड्रिटिक कताई के अध्ययन के लिए सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM)
Chapters
Summary October 2nd, 2021
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सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBEM) को मूर्ति पर लागू किया जाता है और मुरीन हिप्पोकैम्पस में डेंड्रिटिक कताई का विश्लेषण किया जाता है।
Transcript
मस्तिष्क में प्रत्येक न्यूरॉन लगभग 7, 000 synapses द्वारा अन्य न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है। सिवाय इसके कि स्तनधारी मस्तिष्क में वे सिनेप्स मुख्यतः झिल्ली के छोटे फलाव पर स्थित होते हैं जिन्हें डेंड्रिटिक कताई कहा जाता है। सिनेप्स और डेंड्रिटिक कताई और इस तरह की प्लास्टिसिटी, सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण मस्तिष्क कार्य करता है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक पूर्ण अंतर्दृष्टि देता है कि क्या एक डेंड्रिटिक रीढ़ में एक पोस्टसिनैप्टिक इनपुट है। डेंड्रिटिक कताई इमेजिंग पर विभिन्न तकनीकें उपलब्ध हैं। हालांकि, सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एक उच्च संकल्प के साथ ऊतक की बड़ी मात्रा छवि के लिए अद्वितीय संभावना देता है ।
धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक नमूना तैयारी के एक विशेष प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो भारी धातुओं के साथ मजबूत विषम शामिल है । परफ्यूजन के दौरान मेरा प्राथमिक निर्धारण हमें हल्का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक ही दिमाग का उपयोग करने की अनुमति देता है। चूहों का बलिदान किया गया था और एक हल्के प्राथमिक स्थिर के साथ छिद्रित किया गया था।
मस्तिष्क को हिस्सों में काट दिया गया था और एक गोलार्द्ध इम्यूनोफ्लोरेसेंस समर्पित फिक्सेटिव, क्रायोप्रोटेक्टेंट के साथ तय किया गया था, जो क्रायोस्टेट का उपयोग करके कटा हुआ था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययनों के लिए संसाधित किया गया था। जहां दूसरे गोलार्द्ध को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी फिक्सेटिव के साथ तय किया गया था, कंपन के साथ कटा हुआ और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए तैयार किया गया था। धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए मस्तिष्क स्लाइस विपरीत थे, राल में एम्बेडेड फ्लैट, तो हिप्पोकैम्पस के एक CA1 क्षेत्र पिन करने के लिए घुड़सवार और धारावाहिक ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ छवि थी ।
एक पीले बॉक्स में प्रकाश डाला प्रोटोकॉल का हिस्सा वीडियो में चित्रित किया गया था । टिश्यू लें, जिसे फिक्स कर 100 माइक्रोबायोटिक स्लाइस में काटा गया है और इसे तीन मिनट के लिए पांच बार कोल्ड फॉस्फेट बफर से धोएं। 4% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 3% पोटेशियम फेरोसाइनाइड का वन-टू-वन मिश्रण तैयार करें।
अंतिम उत्पाद भूरा हो जाएगा। इस मिश्रण में नमूनों को विसर्जित करें। इसके बाद नमूनों को बर्फ पर रखें।
और इस चरण के बाद से उन्हें प्रकाश से बचाना महत्वपूर्ण है। उन्हें एक घंटे के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट। इस बीच, टीसीएच समाधान तैयार करें।
डबल डिस्टिल्ड वॉटर के 10 मिलीलीटर और 0.1 ग्राम TCH मिलाएं। इसे एक घंटे के लिए 60 सेल्सियस पर सेट ओवन में रखें। समय-समय पर समाधान के लिए तैयार रहना जरूरी है।
तैयार होने पर, इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करें। अब नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं और फिर उन्हें फ़िल्टर किए गए TCH समाधान में विसर्जित करें। स्लाइस काले हो जाएंगे।
उन्हें कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार डबल आसुत पानी से धोएं और उन्हें 30 मिनट के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोऑक्साइड के साथ इनक्यूबेट करें, इस बार कमरे के तापमान पर । फिर, प्रत्येक तीन मिनट के लिए पांच बार डबल आसुत पानी के साथ नमूनों को धोएं और उन्हें फ़िल्टर किए गए 1% या एमिल एसीटेट में रखें।
रात भर उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । अगले दिन, डी-एस्पार्टेट तैयारी के साथ शुरू करें। एस्पार्टिक एसिड समाधान के साथ लीड नाइट्रेट को 60 डिग्री सेल्सियस तक प्री-गर्म करें।
मिश्रण को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में रखें और पीएच को एक मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ 5.5 तक समायोजित करें। लेड एस्पार्टेट के साथ शीशी बंद करें और इसे 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस में छोड़ दें। समाधान स्पष्ट होना चाहिए।
यदि यह बादल बदल जाता है यह त्याग दिया जाना चाहिए और एक नया एक तैयार होने की जरूरत है । इस दौरान नमूनों को तीन मिनट के लिए पांच बार गैस डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं और उन्हें 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। नमूनों को ताजा तैयार लीड एस्पार्टेट समाधान में विसर्जित करें और उन्हें ओवन सेट में 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
एपॉक्सी राल तैयार करें। सामग्री का वजन करें और एक्सीलेटर डीएमपी 30 जोड़ने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए राल को अच्छी तरह से मिलाएं। इथेनॉल के ग्रेडेड कमजोर पड़ने के साथ वायरस तैयार करें।
फिर नमूनों को ओवन से बाहर निकालें और उन्हें फिर से तीन मिनट के लिए पांच बार डबल डिस्टिल्ड पानी से धोएं। इस बीच, 50% राल प्राप्त करने के लिए एक-से-एक अनुपात में 100% इथेनॉल के साथ राल मिलाएं। इसे अच्छी तरह मिला लें।
इसके बाद, पांच मिनट के लिए इथेनॉल के प्रत्येक कमजोर पड़ने में नमूनों को निर्जलित करें। याद रखें कि नमूनों को पूरी तरह से कभी सूख नहीं जाना चाहिए। 30 मिनट के लिए 50% राल में पहले नमूनों घुसपैठ, एक घंटे के लिए 100% राल में अगले, और फिर एक ताजा 100% राल रातोंरात में फिर से।
अगले दिन, नमूनों को एक घंटे के लिए ताजा 100% राल में रखें और फिर उन्हें फ्लोरोपॉलिमर एम्बेडिंग शीट्स के बीच एम्बेड करें। एम्बेडिंग शीट के टुकड़े तैयार करें जिन्हें इथेनॉल के साथ डी-ग्रीस किया गया है और ग्लास स्लाइड को अलग रखा गया है जिसे समर्थन के रूप में उपयोग किया जाएगा। कांच की स्लाइड पर एम्बेडिंग शीट का एक टुकड़ा रखें, उस पर राल की एक बूंद डालें, फिर लकड़ी की छड़ी के उपयोग के साथ नमूने को ध्यान से स्थानांतरित करें।
इसे दूसरे टुकड़े से ढक दें। हवा के बुलबुले से बचने की कोशिश करें। कोमल रहें क्योंकि ऊतक बहुत नाजुक है।
ध्यान से एम्बेडिंग शीट टुकड़ा के शीर्ष पर एक और ग्लास स्लाइड रखें और कम से कम 48 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूना इलाज करें। परतों को अलग करें और एम्बेडेड नमूने के एक टुकड़े को रेजर ब्लेड से काटें। इसे पैराफिन में ट्रांसफर करें।
इससे इलेक्ट्रोस्टैटिक्स के कारण सैंपल खोने का खतरा कम हो जाएगा। एक एल्यूमीनियम पिन लें जिसे इथेनॉल के साथ डी-ग्रीस किया गया है। एक प्रवाहकीय एपॉक्सी को अच्छी तरह से मिलाएं और नमूने को पिन पर माउंट करने के लिए थोड़ी मात्रा का उपयोग करें।
10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाहकीय एपॉक्सी का इलाज करें। हीरे के चाकू के साथ नमूना ब्लॉक के प्रत्येक पक्ष ट्रिम और फिर ऊतक उजागर होने तक ब्लॉक के चेहरे पॉलिश। प्रवाहकीय पेंट का उपयोग करके पिन के लिए नमूना जमीन और यह इलाज।
चार्जिंग को कम करने के लिए, नमूनों को सोने या सोने के पैलेडियम की पतली परत के साथ लेपित भी देखा जाना चाहिए। नमूना के साथ पिन सीरियल ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखें। नमूने को चाकू में संरेखित करें और फिर कक्ष को बंद करें और पैरामीटर सेट करें।
छवियों का एक ढेर ले लीजिए। वर्णित विधि का उपयोग करके, माउस मस्तिष्क ऊतक की छवियां प्राप्त की गईं। हिप्पोकैम्पस एक क्षेत्र की बड़ी छवि ली गई थी और इमेजिंग स्ट्रैटम रेडिएटम के केंद्र में स्थापित की गई थी।
छवियों का एक ढेर प्राप्त किया गया था और ब्याज की वस्तुओं, जैसे कि डेंड्रिटिक कताई और सिनेप्स, खंडित थे। अच्छी गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान को स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली झिल्ली और सिनैप्टिक वेसिकल्स और अच्छी तरह से संरक्षित माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्राप्त किया गया था। पीएसडी 95 एंटीबॉडी के इम्यूनोफ्लोर्सेंट अध्ययनों ने पुष्टि की कि हल्के प्राथमिक निर्धारण और 4% पीएफए के साथ पारंपरिक निर्धारण तुलनीय परिणाम देते हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीरियल ब्लॉक आधारित स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक आकृति विज्ञान, और 12 दृश्य झिल्ली के उपयोग के साथ मस्तिष्क ऊतक छवियों के अधिग्रहण में सक्षम बनाता है 10 सही विभाजन और पुनर्निर्माण की सुविधा । मेरे प्राथमिक निर्धारण ने पीएसडी 95 इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग डेन्ड्रिटिक कताई के विश्लेषण के लिए एक ही दिमाग का उपयोग करना संभव बनाया। यहां हम पीएसई 9, 500 नवोदित का उपयोग करते हैं।
हालांकि, दूसरे के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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