Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBEM) for studiet av dendritiske spines

Hver nevron i hjernen er forbundet med andre nevronceller med ca. 7000 synapser. Bortsett fra at de synapsene i pattedyrhjernen hovedsakelig ligger på de små fremspringene i membranen som kalles dendrittiske spines. Plastisitet av synapser og dendritiske spines og lignende, så viktige hjernefunksjoner som læring og minneprosesser.

Det er viktig å merke seg at bare elektronmikroskopi gir full innsikt om en dendritisk ryggrad har en postsynaptisk inngang. Ulike teknikker på dendritic spines avbildning er tilgjengelig. Seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi gir imidlertid unik mulighet til å avbilde stort volum vev med høy oppløsning.

Seriell blokkbasert skanningselektronmikroskopiteknikk krever en spesiell protokoll for prøvepreparering som innebærer sterk kontrast til tungmetaller. Min primære fiksering under perfusjon tillot oss å bruke de samme hjernene for lettere elektronmikroskopi. Mus ble ofret og perfundert med et mildt primært fikseringsmiddel.

Hjernen ble kuttet i halvdeler og en halvkule ble postfast med immunfluorescens dedikert fixative, kryorotectant, skiver ved hjelp av en kryostat og behandlet for immunfluorescence studier. Hvor den andre halvkule ble stiftet med elektronmikroskopifiksativ, skivet med vibratomet og forberedt på elektronmikroskopistudier. Hjerneskiver for seriell blokkbasert skanning elektronmikroskopistudier ble kontrastert, flat innebygd i harpiks, deretter ble en CA1-region av hippocampus montert på pinnen og avbildet med det serielle blokkbaserte skanneelektronmikroskopet.

Den delen av protokollen som er uthevet i en gul boks, ble omtalt i videoen. Ta vevet, som er løst og kuttet i 100 mikrobiotiske skiver og vask det med kald fosfatbuffer fem ganger i tre minutter hver. Forbered en en-til-en blanding av 4% osmium tetroxide og 3% kalium ferrocyanid.

Sluttproduktet blir brunt. Senk prøvene ned i denne blandingen. Legg deretter prøvene på is.

Og fra dette stadiet og fremover er det viktig å beskytte dem mot lys. Inkuber dem med mild risting i en time. I mellomtiden forbereder du TCH-løsningen.

Bland 10 milliliter dobbelt destillert vann og 0,1 gram TCH. Plasser den i en ovn satt til 60 Celsius i en time. Det er viktig å swill løsningen fra tid til annen.

Når du er klar, avkjøl den til romtemperaturen. Vask nå prøvene med dobbelt destillert vann fem ganger i tre minutter hver, og senk dem deretter ned i filtrert TCH-løsning. Skivene blir svarte.

Inkuber dem i 20 minutter ved romtemperatur. Vask prøvene med dobbelt destillert vann fem ganger i tre minutter hver og inkuber dem med 2% osmium tetroxide i 30 minutter, denne gangen ved romtemperatur. Igjen, vask prøvene med dobbelt destillert vann fem ganger i tre minutter hver og legg dem i filtrert 1% eller amylacetat.

Inkuber dem ved fire grader Celsius over natten. Neste dag begynner du med D-aspartatforberedelse. Bland blynitrat med aspartinsyreoppløsning forvarmet til 60 grader Celsius.

Plasser blandingen i et vannbad satt til 60 grader Celsius og juster pH til 5,5 med en molar natriumhydroksid. Lukk hetteglasset med bly aspartat og la det stå i 60 grader Celsius i 30 minutter. Løsningen skal være klar.

Hvis det blir overskyet, må det kastes og en ny må utarbeides. I mellomtiden vasker du prøvene med gassdobbelt destillert vann fem ganger i tre minutter hver og holder dem i ovnen ved 60 grader Celsius i 30 minutter. Senk prøvene i den nylagde bly aspartatløsningen og inkuber dem i ovnen satt til 60 grader Celsius i 20 minutter.

Forbered epoksyharpiks. Vei ingrediensene og bland harpiksen godt i minst 30 minutter før du tilsetter akselerator DMP 30. Forbered virus med gradert fortynning av etanol.

Ta deretter prøvene ut av ovnen og vask dem igjen med dobbelt destillert vann fem ganger i tre minutter hver. I mellomtiden blander du harpiksen med 100% etanol i en-til-en-andel for å få 50% harpiks. Bland det godt.

Etter dette dehydrerer du prøvene i hver fortynning av etanol i fem minutter. Husk at prøvene aldri må tørke helt. Infiltrer prøvene først i 50% harpiks i 30 minutter, neste i 100% harpiks i en time, og deretter igjen i en frisk 100% harpiks over natten.

Neste dag legger du prøvene i fersk 100% harpiks i en time og legger dem deretter inn mellom fluoropolymer innebyggingsplater. Forbered biter av innbyggingsplate som har blitt avsmurt med etanol og legg til side glasssklier som skal brukes som støtte. Legg et stykke innebyggingsark på en glasssklie, legg en dråpe harpiks på den, og overfør deretter prøven nøye ved bruk av trepinne.

Dekk det med det andre stykket. Prøv å unngå luftbobler. Vær forsiktig da vevet er veldig skjøre.

Plasser forsiktig et annet glasssklie på toppen av det innebygde arkstykket og herd prøven i ovnen ved 70 grader Celsius i minst 48 timer. Skill lagene og klipp et stykke av den innebygde prøven med et barberblad. Overfør den til parafin.

Dette vil minimere faren for å miste prøven på grunn av elektrostatikk. Ta en aluminiumspinne som er avsmurt med etanol. Bland en ledende epoksybrønn og bruk litt av den til å montere prøven på pinnen.

Herd ledende epoksy ved 70 grader Celsius i 10 minutter. Trim hver side av prøveblokken med diamantkniven og poler deretter ansiktet på blokken til vevet er utsatt. Jord prøven til pinnen ved hjelp av ledende maling og kurere den.

For å minimere ladingen, bør prøvene også oppdages belagt med et tynt lag gull eller gull palladium. Plasser pinnen med prøven i kammeret til det serielle blokkbaserte skanneelektronmikroskopet. Juster prøven til kniven, lukk deretter kammeret og sett parametrene.

Samle en stabel med bilder. Ved hjelp av den beskrevne metoden ble det oppnådd bilder av musens hjernevev. Det store bildet av hippocampus en region ble tatt og bildet ble satt i sentrum av stratum radiatum.

En stabel med bilder ble anskaffet og gjenstandene av interesse, for eksempel dendritiske spines og synapser, ble segmentert. God kvalitet vev morfologi ble oppnådd med tydelig synlige membraner og synaptiske vesikler og godt bevart mitokondrier. Immunfluoreserende studier av PSD 95 antistoff bekreftet at mild primær fiksering og tradisjonell fiksering med 4% PFA gir sammenlignbare resultater.

Presentert protokoll muliggjør oppkjøp av hjernevevsbilder ved bruk av seriell blokkbasert skanningselektronmikroskopi, vevsmorfologi av høy kvalitet og 12 synlige membraner letter 10 riktige segmentering og rekonstruksjon. Min primære fiksering gjorde det mulig å bruke de samme hjernene til analyse av PSD 95 immunfluorescens og elektronmikroskopiavbildning av dendrittiske spines. Her bruker vi PSE 9, 500 spirende.

Den andre kan imidlertid også brukes.