Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kombinert mekanisk og enzymatisk dissosiasjon av mus hjerne hippocampal vev
Chapters
Summary October 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne nevrale celledissosiasjonsprotokollen er beregnet på prøver med lav mengde startmateriale og gir en svært levedyktig encellet suspensjon for nedstrømsanalyse, med valgfrie fikserings- og fargingstrinn.
Transcript
Vellykket dissosiering av små mengder nevralt vev kan utstyre laboratorier for å få strukturspesifikk innsikt i behandlingseffekt, cellulær funksjon, samt sykdoms- og behandlingsmekanismer for handling. Denne nevrale dissosiasjonsprotokollen gir konsekvent en svært levedyktig og faktisk encellet suspensjon. I tillegg kan vi behandle prøver som bare er en brøkdel av de som de kommersielle settene er ment for.
Riktig planlegging og forberedelse er nøkkelen til et vellykket resultat for denne teknikken. Å kjøre flere øvelsesrunder for å gjøre deg kjent med protokollen ville være gunstig. Etter bedøvelse av en seks måneder gammel kvinnelig C57BL / 6J mus, klem underlivet og løft huden ved hjelp av tang.
Deretter bruker du saks, kutt gjennom pelsen og huden til bunnen av ribcage. Lag to diagonale snitt som begynner under ribbeina og beveger seg mot hver skulder. Resect deretter forsiktig membranen og ribcage for å eksponere hjertet.
Etter forsiktig fjerning av bindevev rundt hjertet, bruk saks for å klippe riktig atrium. Slå deretter av isofluranstrømmen til pusteren. Hold hjertet stødig med tang og med skråningen av sommerfuglnålen vendt opp, pierce venstre ventrikel mens du holder nålen jevn og parallell med dyret.
Deretter holder du nålen på plass, slår på pumpen og parfymerer minst 30 milliliter saltvanns- eller heparinoppløsningen til væsken som forlater hjertet er ugjennomsiktig og leveren og lungene blek i fargen. Etter perfusjon, slå av pumpen, fjern nålen og overfør musen til disseksjonsområdet. Etter halshugging, kutt pelsen fra baksiden av hodet opp til øynene og skrell huden tilbake for å avsløre skallen.
Klipp deretter skallen mellom øynene og lag to kutt på baksiden av skallen ved 10 og 2-timers posisjoner. Deretter gjør du et langt kutt langs midtsagittallinjen på skallen til det opprinnelige kuttet mellom øynene. Deretter, ved hjelp av tang, skrell de to halvdelene av skallen bort til sidene.
Bruk deretter en spatel for å fjerne hjernen og legg den i en 60 millimeter glass Petri-tallerken fylt med kald DPBS og holdt på is. Bruk en skalpell eller barberhøvel, skille hver halvkule og fjern olfaktoriske pærer og cerebellum. Fjern deretter midbrain til hippocampus er utsatt.
Deretter sikrer du hjernen med tang. Deretter bruker du et annet sett med tang, forsiktig erter hippocampus ut av hver halvkule. Overfør begge hippocampiene til et merket 1,5 milliliterrør som inneholder kald DPBS og legg røret på is.
Bruk tang, overfør hippocampi vev stykker til et C-rør og tilsett 30 mikroliter av enzymblanding 2 inn i røret. Etter å ha vridd hetten og strammet til den klikker, plasser røret i en dissosiator og kjør riktig program. Mens programmet kjører, pre-wet en 70 mikron celle sil plassert på en 50 milliliter konisk rør med to milliliter BSA buffer.
Etter at dissosiasjonsprogrammet er fullført, legg til fire milliliter BSA-buffer til det dissosierte vevet og filtrer blandingen gjennom cellesilen på det 50 milliliter koniske røret. Deretter legger du til 10 milliliter DPBS til C-røret. Lukk deretter røret, virvle løsningen forsiktig og filtrer den gjennom cellesilen på det koniske røret på 50 milliliter.
Sentrifuger den filtrerte cellefjæringen, kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen og lagre pelletsen. For fjerning av rusk, resuspender pellet med 1550 mikroliter kald DPBS og overfør suspensjonen til et merket 50 milliliter konisk rør. Tilsett deretter 450 mikroliter kaldt avfallsfjerningsløsning og pipette opp og ned.
Legg celleopphenget forsiktig med en milliliter kald DPBS, og hold spissen mot veggen på det koniske røret. Gjenta prosedyren til det totale overlegget er to milliliter. Deretter sentrifugerer suspensjonen ved 3000 ganger G i 10 minutter med full akselerasjon og full pause.
Aspirer det øverste laget, og sveip deretter pipettespissen frem og tilbake for å aspirere det hvite mellomlaget. Fjern så mye av mellomlaget som mulig uten å forstyrre det nederste laget. Deretter legger du til to milliliter kald DPBS og pipette opp og ned for å blande.
Sentrifuger deretter suspensjonen ved 1000 ganger G i 10 minutter med full akselerasjon og full pause. Etter sentrifugering, kast supernatanten og resuspend pellet i en milliliter BSA buffer. Etter celletelling, sentrifugere gjenværende celle suspensjon og resuspend pellet i 50 mikroliter fortynnet levende død flekk.
Overfør deretter prøven til et merket strømningsrør og inkuber ved romtemperatur i 8 til 10 minutter i mørket. Etter inkubasjon legger du til 500 mikroliter BSA-buffer og gjentar sentrifugeringstrinnet. Kast deretter supernatanten, og la en liten mengde buffer i røret.
Hovedporten utelukket rusk i fremoverspredningen kontra sidespredningsplottene, og de døde cellene ble senere utelukket. Den andre porten utelukket celler positive for myelin grunnleggende protein. Og av de resterende cellene ble tetthetsplott av celler positive for hver fluorokrom opprettet.
Frekvensen av hver nevronal cellepopulasjon ble beregnet ut av den tredje porten. Prøver behandlet med manuell mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse ga en vesentlig lavere populasjon av celler av interesse, mens både friske og faste prøver behandlet med automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse viste en flere ganger høyere populasjon av celler av interesse. Selv om trinnene for fjerning av perfusjon og rusk kan være utfordrende i utgangspunktet, kan det å opprettholde en jevn og stødig hånd bidra til å sikre suksess.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
