Summary
Denne nevrale celledissosiasjonsprotokollen er beregnet på prøver med lav mengde startmateriale og gir en svært levedyktig encellet suspensjon for nedstrømsanalyse, med valgfrie fikserings- og fargingstrinn.
Abstract
Denne nevrale dissosiasjonsprotokollen (en tilpasning av protokollen som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett) optimaliserer vevsbehandling som forberedelse til detaljert nedstrømsanalyse som strømningscytometri eller encellet sekvensering. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel bruk av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av disse. Den delikate naturen til nevronceller kan komplisere innsatsen for å oppnå den svært levedyktige, sanne encellede suspensjonen med minimal cellulært rusk som kreves for encellet analyse. Dataene viser at denne kombinasjonen av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse konsekvent gir en svært levedyktig (>90%) encellet suspensjon, og overvinner de nevnte vanskelighetene. Selv om noen få av trinnene krever manuell fingerferdighet, reduserer disse trinnene prøvehåndtering og potensielt celletap. Dette manuskriptet beskriver hvert trinn i prosessen for å utstyre andre laboratorier for å lykkes med å fjerne små mengder nevralt vev som forberedelse til nedstrømsanalyse.
Introduction
Hippocampus ble først beskrevet av en bolognesisk anatomist, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-1. Ved å navngi denne nyvunne strukturen ble Aranzio sannsynligvis inspirert av sin uhyggelige likhet med sjøhesten til slekten Hippocampus1. Hippocampus er involvert i stressresponser, men er allment kjent for sin rolle i læring og hukommelse. Mer spesifikt er hippocampus ansvarlig for koding og gjenfinning av deklarativt og romlig minne1.
Hippocampus, eller hippocampus riktig, er delt inn i CA1 (cornu ammonis), CA2 og CA3 underfelt1. Sammenlignet med resten av nervesystemet har hippocampus flere unike definerende egenskaper, inkludert plastisitet og potensial for pågående nevrogenese2. Neurogenese er prosessen med spredning og differensiering av nevrale stamceller, etterfulgt av deres integrasjon i det eksisterende nevronale nettverket. Neurogenese er begrenset til den subgranulære sonen av dentate gyrus og subventrikulær sone av laterale ventrikler (og olfaktoriske pærer)3. Mens neurogenese er rikelig i embryogenese, er det en livslang prosess 3,4. Som sådan vil denne diskusjonen fokusere på voksen neurogenese i hippocampus.
De subventrikulære og subgranulære sonene er nevrogene nisjer som inneholder ependymale og vaskulære celler, samt umodne og modne avstamninger av nevrale stamceller5. Mikroglia bidrar til disse nisjene som immunceller for å regulere nevrogenese6. Nevrale stamceller er nonstem celleavkom av nevrale stamceller7. Tre typer nevrale forfedre er til stede i den subventrikulære sonen: radial glia-lignende type B-celler, type C transittforsterkningsforsterkere og type A nevroblaster 3,8. De langsomt delte type B nevrale stamceller i den subventrikulære sonen kan skille seg ut i raskt å dele type C-celler8. Deretter skiller C-celler seg ut i type A-cellene8. Disse nevroblaster migrerer gjennom rostral migrasjonsstrømmen til den olfaktoriske pæren før de differensierer til interneuroner eller oligodendrocytter9. Disse olfaktoriske pære internurons er nøkkelen til olfaktorisk kortsiktig minne, og assosiativ læring, mens oligodendrocytter myelinate axoner av corpus callosum9. Flertallet av voksen neurogenese forekommer i den subgranulære sonen av dentate gyrus, hvor radial type 1 og ikke-radioell type 2 nevrale forfedre er funnet3. De fleste nevrale stamceller er bestemt til å bli dentate granulat nevroner og astrocytter10. Forbundet med gapkryss danner astrocytter nettverk for å modulere plastisitet, synaptisk aktivitet og nevronal spenning5. Som den primære eksitatoriske nevronen i dentate gyrus gir granulatceller innspill fra entorhinal cortex til CA3-regionen11.
Nevrale stamcellepopulasjoner kan isoleres ved hjelp av immunomgnetiske eller immunfluoreserende isolasjonsstrategier12,13. Nevralt vev er spesielt vanskelig å dissosiere; forsøk på å gjøre dette resulterer ofte i prøver med dårlig celle levedyktighet og / eller unnlater å produsere den nødvendige encellede suspensjonen for nedstrømsanalyse. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel ved hjelp av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av teknikker14,15. I en studie som evaluerte nevrale dissosiasjonsmetoder, ble levedyktigheten og kvaliteten på manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturering versus kombinasjoner av pipettetrianturering og fordøyelse med ulike enzymer sammenlignetmed 15. Kvaliteten ble gradert basert på mengden celleklumper og DNA eller subcellulært rusk i den tilberedte suspensjonen15. Suspensjoner av glial svulster utsatt for manuell mekanisk dissosiasjon alene hadde betydelig lavere celle levedyktighet enn behandlinger med dispase eller en kombinasjon av DNase, kollagenase og hyaluronidase15. Volovitz et al. anerkjente variasjonen i levedyktighet og kvalitet mellom de ulike metodene og understreket at utilstrekkelig dissosiasjon kan redusere nøyaktigheten av nedstrømsanalyse15.
I en egen studie sammenlignet forfatterne over 60 forskjellige metoder og kombinasjoner av dissosiasjon av dyrkede nevronceller14. Disse metodene inkluderte åtte forskjellige variasjoner av manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturasjon, en sammenligning av inkubasjon med fem individuelle enzymer med tre forskjellige intervaller, og ulike kombinasjoner av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse eller kombinasjonen av to enzymer14. Ingen av de mekaniske metodene ga en encellet suspensjon14. Fire av de enkle enzymbehandlingene, ti av kombinasjonen enzymatiske behandlinger og fire av kombinasjonene av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse ga en encellet suspensjon14. Enzymatisk fordøyelse med TrypLE etterfulgt av Trypsin-EDTA dissosierte prøver14. For øvrig hadde prøver behandlet med TrypLE og/eller Trypsin-EDTA en tendens til å danne gelatinøse klumper14. Mens denne studien ble utført på dyrkede celler, snakker den til manglene ved pipettetrianturering eller enzymatisk fordøyelse alene.
Side-ved-side sammenligninger av manuell versus automatisert mekanisk dissosiasjon mangler. Imidlertid kjørte en gruppe flowcytometri for å sammenligne manuell og halvautomatisk mekanisk dissosiasjon av hele musehjerner i forbindelse med kommersiell papain eller trypsin enzymatisk dissosiasjonssett16. Behandling med dissosiatoren ga mer konsekvent levedyktige celler16. Etter dissosiasjon isolerte forfatterne også Prominin-1 celler, nevronale forløperceller og mikroglia16. For to av de tre isolerte cellepopulasjonene var renheten til de isolerte cellene litt høyere når prøver ble behandlet med dissociatoren, sammenlignet med manuelt16. Reiß et al. bemerket at person-til-person variabilitet i pipetteringsteknikk hindrer reproduserbarhet av levedyktig cellepopulasjonsutbytte i vevsdissosiasjon16. Forfatterne konkluderte med at automatisert mekanisk dissosiasjon standardiserer prøvebehandling16.
Metoden for dissosiasjon skissert i dette manuskriptet er en kombinasjon av helautomatisk mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse, ved hjelp av løsninger som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett17. I motsetning til standardprotokoller reduserer denne optimaliserte protokollen prøvemanipulering, gir en svært levedyktig encellet suspensjon, og er ment for behandling av minimale mengder startvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ble utført i samsvar med de etiske standardene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved UAMS. 6 måneder gamle kvinnelige C57Bl6/J villmus ble kjøpt og gruppehus (4 mus per bur) under en konstant 12 timers lys / mørk syklus.
1. Utarbeidelse av reagenser
- Forbered fikserbar live / død flekk lagerløsning. Rekonstituer fluorescerende flekk med 20 μL dimetylsulfoksid (DMSO).
- Pakk hetteglasset i folie, merk det som "Rekonstituert", og oppbevar det ved -20 °C i opptil seks måneder.
- Forbered en 0,9% saltløsning med heparin. Fortynn innholdet i ett hetteglass med heparinnatrium (10 000 USP-enheter per 10 ml) i 1 L dobbeltdestillert vann (ddH2O).
- Forbered nok til ca. 45 ml per dyr og oppbevar ved 4 °C i opptil en uke.
- Lag 1% paraformaldehyd (PFA).
- Varm opp en varm plate til 50 °C i en avtrekkshette. I en mikrobølgeovn varmes 100 ml ddH2O i et glassbeger til ca. 60 °C. Tilsett en magnetisk rørestang og overfør til varmeplaten.
- I avtrekkshetten veier du ut 1 g PFA og legger til begeret på ddH2O. Tilsett 0,1125 g NaOH-krystaller og bland til det er oppløst (5-10 min).
- Tilsett 0,4 g NaPO4-monobasisk og bland til den er oppløst (2-5 min). Støvsug løsningen og juster pH til 7.4 med HCl og NaOH.
- Avkjøl på is eller ved 4 °C i 30 minutter før lagring.
MERK: Aliquots på 1,5 ml kan oppbevares ved -20 °C i ett år. Unngå fryse-tine sykluser. Hvis løsningen etter opptining blir overskyet eller et bunnfall har dannet seg, bør løsningen ikke brukes.
FORSIKTIG: Giftig, brannfarlig. Arbeid alltid med PFA under en ventilert hette med riktig personlig verneutstyr.
- Resuspend lyofilisert enzym A med 1 ml buffer A. Ikke virvel løsningen.
MERK: Enzym A og buffer A samt bufferE A, Y og Z er reagenser i det kommersielle Adult Brain Dissociation Kit17. - Del enzyme P i aliquots på 50 μL og resuspend Enzyme A i 10 μL aliquots. Oppbevars ved -20 °C i opptil seks måneder. Unngå fryse-tine sykluser.
2. Dag for eksperiment
- Avkjøl sentrifugen på bordplaten til 4 °C.
- Plasser aliquot(er) av PFA i kjøleskapet for gradvis opptining.
- Plasser den rekonstituerte levende/døde flekken i mørket (f.eks. en skuff) for å tine ved romtemperatur.
- Klargjør bovint serumalbumin (BSA) Buffer. Tilsett 0,5 g BSA til 100 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede oppløsning uten kalsium og magnesium (D-PBS), pH 7.2.
- Tilsett en rørestang og bland på en røreplate i 30 min. Overfør til 50 ml koniske rør og oppbevar ved 4 °C.
MERK: Bruk alltid nylaget BSA-buffer. - Forbered levende/ død flekk som fungerer fortynning. Tilsett 1 μL av den rekonstituerte levende/døde flekklagerløsningen til 360 μL D-PBS og oppbevar den i mørket (f.eks. en skuff eller boks) ved romtemperatur. Forbered 50 μL av arbeidsfortynning per prøve.
3. Perfusjon
- Plasser saltoppløsningen med heparin på is.
- Slå på oksygen, sett strømningsmålerindikatorkulen på det lille anestesidampersystemet til 1 l/min. Sørg for tilstrekkelig oksygentrykk og isofluran.
- Juster fordamperhjulet til 3,5 % (for induksjon og vedlikehold).
- Klargjør perfusjonspumpelinjene med saltvanns-/heparinløsningen. Sett hastigheten til 6 ml/min.
- Plasser musen i induksjonskammeret, slå på pusten, og vent noen minutter til musen ikke svarer. Bekreft tilstrekkelig dybde av anestesi gjennom fravær av pedaluttak til skadelig klemme.
- Plasser musen på ryggen på disseksjonsbrettet med nesen i nesekjeglen. Utfør en sekundær bekreftelse på full bedøvelse gjennom fravær av pedaluttak til skadelig klype. Fest alle fire potene til brettet.
- Spray dyrets mage med 20% etanol.
- Bruk tang, klem underlivet og løft huden. Bruk saks til å kutte gjennom pels og hud til bunnen av ribbeina.
- Lag to diagonale snitt fra under ribbeina mot hver skulder.
- Resect membranen forsiktig (unngå lunger og hjerte). Resect ribbeina for å eksponere hjertet.
- Fjern forsiktig eventuelt bindevev rundt hjertet.
MERK: Trinn 3.10-3.11 er kritiske; utføre med ferdigheter og fingerferdighet. - Bruk saksen til å klippe høyre atrium (mørk lobe øverst til venstre i hjertet). Slå av strømmen av isofluran til pusteren.
- Hold hjertet stødig med tang. Med skråningen av sommerfuglnålen vendt opp, pierce venstre ventrikel mens du holder nålen jevn og parallell med dyret.
- Hold nålen på plass, slå på pumpen og perfuse minst 30 ml saltvanns-/heparinoppløsningen til væsken som forlater hjertet er ugjennomsiktig og leveren og lungene bleke i fargen.
MERK: Trinn 3.13-3.14 er kritiske; utføre med ferdigheter og fingerferdighet. - Slå av pumpen, fjern nålen og overfør musen til disseksjonsområdet.
4. Disseksjon
- Bruk stor kirurgisk saks, halshugge hodet.
- Klipp pelsen fra baksiden av hodet opp til øynene. Skrell huden tilbake for å eksponere skallen.
- Klipp skallen mellom øynene. Lag to kutt på baksiden av skallen, ved 10 og 2-tiden, og gjør deretter ett langt kutt (hold tips opp for å unngå å skade hjernen) langs midtsagittallinjen på skallen til det opprinnelige kuttet mellom øynene.
- Bruk tang til å skrelle de to halvdelene av skallen bort til sidene. Bruk en slikkepott til å fjerne hjernen og plassere den i en Petri-tallerken på 60 mm på is fylt med kald D-PBS (figur 1).
- Bruk en skalpell eller barberhøvel for å skille hver halvkule. Fjern deretter olfaktoriske pærer og cerebellum.
- Bruk tang for å fjerne midbrain til hippocampus er utsatt.
- Sikre hjernen med tang. Bruk et annet sett med tang, ert forsiktig ut av hver halvkule, og overfør begge hippocampi til et merket 1,5 ml rør som inneholder kald D-PBS.
- Plasser prøverøret som inneholder de to hippocampiene fra musen på is.
5. Forbered enzymblanding 1 og 2 for hver prøve
MERK: For volumer som er større enn 2 ml, bruk en 10 ml serologisk pipette; For volumer, 200 μL-2 ml, bruk en 1000 μL pipette; For volumer, 21-199 μL, bruk en 200 μL pipette; For volumer, 2-20 μL, bruk en 20 μL pipette; For volumer under 2 μL, bruk en 0-2 μL pipette.
- For hver prøve, tine en aliquot hver av Enzyme P og Enzyme A ved romtemperatur.
- For enzymblanding 1 kombinerer du 50 μL enzym P og 1900 μL buffer Z i et merket C-rør (materialtabell).
- For enzymblanding 2, tilsett 20 μL buffer Y til den opptinte 10 μL aliquot av enzymet A.
6. Voksen hjernedissosiasjonsprotokoll17
MERK: Når du arbeider med prøver, bør rør plasseres i et rørstativ ved romtemperatur mens BSA og D-PBS forblir på is med mindre annet er angitt.
- Slå på dissosiatoren.
- Bruk tang til å overføre hippocampi vev stykker til C Tube.
- Overfør 30 μL enzymblanding 2 til C-røret. Vri hetten til spenningen merkes, og stram deretter til den klikker.
- Plasser C-røret opp ned i en posisjon av dissosiatoren; Eksemplet får statusen Valgt (figur 2). Fest varmeren over C-røret.
- Trykk mappeikonet, velg Favoritter-mappen , bla til og velg 37C_ABDK_02 program. Klikk på OK for å bruke programmet på alle valgte C-rør, og trykk deretter på Start (figur 2).
- Merk ett konisk rør på 50 ml per prøve.
- Plasser en 70 μm cellesil på hvert 50 ml koniske rør og vått med 2 ml BSA-buffer.
- Når programmet er fullført, fjerner du varmeapparatet og C-røret fra dissosiatoren.
- Tilsett 4 ml BSA-buffer i prøven og påfør blandingen på cellesilen på det koniske røret på 50 ml.
- Tilsett 10 ml D-PBS i C-røret, lukk det og virvle løsningen forsiktig. Påfør den på cellesilen på det koniske røret på 50 ml.
- Kast cellesilen og C-røret. Sentrifuger suspensjonen ved 300 x g i 10 min ved 4 °C. Deretter aspirerer og kaster du supernatanten.
7. Fjerning av rusk
- Resuspend pellet med 1550 μL kald D-PBS og overfør suspensjonen til et merket 15 ml konisk rør.
- Tilsett 450 μL kaldt avfall Fjerning Løsning og pipette opp og ned (ikke virvel).
MERK: Avfallsfjerningsløsningen er et reagens i det kommersielle Voksen Brian Dissociation Kit17. - Legg forsiktig 1 ml kaldt D-PBS på toppen av cellefjæringen, og hold spissen mot veggen på det koniske røret. Gjenta til det totale overlegget er 2 ml.
MERK: Dette trinnet er kritisk; utføre med ferdigheter og fingerferdighet. - Sentrifuge ved 3000 x g i 10 min ved 4 °C med full akselerasjon og full brems.
MERK: Hvis fasene ikke er tydelig separert, gjentar du trinn 7.2-7.3. Sentrifuger en siste gang ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C. - Suspensjonen skal nå bestå av tre forskjellige lag (figur 3). Aspirer det øverste laget. Feie pipettespissen frem og tilbake for å aspirere det hvite midtlaget. Fjern så mye av mellomlaget som mulig uten å forstyrre det nederste laget.
MERK: Dette trinnet er kritisk; utføre med ferdigheter og fingerferdighet. - Tilsett 2 ml kald D-PBS og pipette opp og ned for å blande.
- Sentrifuge ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C med full akselerasjon og full brems. Aspirer og kast supernatanten. Bestem pelletsen på nytt i 1 ml BSA-buffer.
MERK: Celler kan brukes på nytt i riktig buffer som deretter er magnetisk merket og isolert som forberedelse til sekvensering av enkeltceller på dette tidspunktet.
8. Antall celler
- Utfør celletelling i henhold til produsentens protokoll for tilgjengelig celleteller (ett alternativ er angitt i materialtabellen)
9. Levende / død flekk
- Sentrifuger de resterende 900 μL (fra 7,7) ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C med full akselerasjon og full brems.
- Mens prøven spinner, merker du ett strømningsrør per prøve og pakker det inn i folie for å begrense lyseksponeringen.
- Aspirer og kast supernatanten.
- Resuspend pellet i 50 μL fortynnet levende / død flekk (tidligere tilberedt).
MERK: Dette trinnet skal utføres i en innstilling med lite lys. Slå av overhead romlys for å oppnå dette. - Overfør hver prøve til det tilsvarende merkede strømningsrøret og inkuber ved romtemperatur i 8-10 min i mørket (f.eks. en skuff eller boks).
- Tilsett 500 μL BSA buffer og sentrifuge ved 1000 x g i 10 min ved 4 °C med full akselerasjon og full brems.
- Aspirer og kast supernatanten.
MERK: Pelletsen er kanskje ikke synlig. la en liten mengde buffer ligge bak for ikke å utilsiktet aspirere pelletsen. Celler kan brukes på nytt i riktig buffer, blokkert og farget med cellespesifikke antistoffer på dette tidspunktet. Se Tilleggsfil 1 for eksempelprotokoll18.
10. Fiksering (valgfritt)
- Resuspend pellets i 200 μL av 1% PFA (tidligere utarbeidet). Inkuber i 15 min ved 4 °C.
- Vask ved å tilsette 500 μL D-PBS og sentrifuge ved 300 x g i 10 min ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten.
MERK: Pelletsen er kanskje ikke synlig. la en liten mengde buffer ligge bak for ikke å utilsiktet aspirere pelletsen. - Resuspend pellet i 200 μL D-PBS og lagre ved 4 °C i opptil 3 dager.
11. Strømningscytometri
- Merk filterhettene på de nye rørene.
- Bruk en 1 ml pipette og pipette hver prøve på filterhetten.
- Sentrifuge kort ved 200 x g ved 4 °C, slik at sentrifugen kan nå 200 x g før du stopper løpet.
- Fortsett å strømme cytometrikjernen for nedstrømsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prøver ble behandlet med et strømningscytometer ved et kjerneanlegg, og de resulterende dataene ble evaluert med en programvarepakke for strømningsanalyse. Tidligere ble kompensasjonskontroller analysert - levende / død flekk og negativ kontroll. Hvis flere fluorokromer brukes, bør fluorescens minus en (FMO) kontroller og enkeltflekkkontroller fremstilles for hvert antistoff. Kompensasjon for spektral overlapping for eksperimentelle prøver ble beregnet basert på de analyserte kontrollene. For identifikasjon av cellepopulasjon ble det brukt en hierarkisk gatingstrategi. Hovedporten ekskluderte rusk i fremoverspredningen (cellestørrelse) kontra sidespredning (granularitet) plott19,20. Deretter ble de døde cellene utelukket (figur 4, figur 5, figur 6, supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3 og supplerende figur 4). Følgende port ekskluderte celler positive for Myelin Basic Protein (Supplemental Figure 4). Av de resterende cellene ble tetthetsplott av celler positive for hver fluorokrom opprettet (Supplerende figur 4). Frekvensen for hver nevroncellepopulasjon ble beregnet ut av den tredje porten (supplerende figur 4). Prøver som ble behandlet med manuell mekanisk dissosiasjon21 og enzymatisk fordøyelse ga en vesentlig lavere populasjon av celler av interesse (Tilleggsfil 2 21, figur 4 og supplerende figur 1). På den annen side returnerte både faste og ferske prøver utarbeidet via automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse en populasjon av celler av interesse flere ganger større (figur 5, figur 6, supplerende figur 2 og supplerende figur 3).
Figur 1: Musehjerne. (A) Riktig perfundert. (B) Ikke-perfused. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Valgt status i trinn 6.4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trelags suspensjon i trinn 7.5: Buffer (øverste lag), celleavfall, avfallsfjerningsløsning og celler (nederste lag). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ analyse av faste prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av manuell dissosiasjon av Pasteur pipettetrianturasjon og enzymatisk fordøyelse. Første av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representativ analyse av ferske prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Første av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representativ analyse av faste prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Første av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Representativ analyse av faste prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av manuell Pasteur pipettetrianturasjonsdissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Andre av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Representativ analyse av ferske prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Andre av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Representativ analyse av faste prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. Andre av to prøver behandles samtidig. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Representativ analyse av fargede og faste prøver behandlet ved hjelp av en kombinasjon av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse. (A) Prosentandelen av celler som er den cellulære populasjonen av interesse. (B) Andel av den interessepopulasjonen som er levende celler. (C). MBP- Celler. (D). PSA-NCAM+ -celler (Neuronal Precursor Cells). (E). ACSA2+- celler (Astrocytter). (F). CD31+ celler (endotel). (G). CD11b+ celler (Microglia). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Fargeprotokoll. En prøvefargingsprotokoll for immunisering av celleoverflatemarkører. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Tilpasset manuell mekanisk og enzymatisk dissosiasjonsprotokoll. Denne metoden er tilpasset fra en tidligere publisert protokoll21. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere trinn i denne nevrale dissosiasjonsprotokollen krever dyktig teknikk og fingerferdighet-perfusjon, supernatant aspirasjon og myelinfjerning. Gjennom perfusjonsprosessen må de indre organene forbli intakte (bortsett fra å fjerne membranen og klippe hjertet); Dette inkluderer å unngå hjertets øvre kamre med sommerfuglnålen. Mens mengden saltvann med heparin som trengs varierer, indikerer gjennomsiktig væske som strømmer fra hjertet at prosessen er fullført. Hjernen må være helt og riktig perfundert, og da vil den virke off-white (figur 1). Ved perfusjon blir det røde blodlegemerfjerningstrinnet fremmed, og eliminerer overflødig manipulering av prøvene som kan føre til celletap. Deretter krever fjerningstrinnet for rusk en jevn hånd. For at sentrifugeringen skal resultere i klart definerte lag etter D-PBS-overlegget (figur 3), må lagene ikke forstyrres under transport eller under pipettering. I tillegg, når du aspirerer de to øverste lagene, må nok suspensjon fjernes for å eliminere overdreven celleavfall mens du fortsatt etterlater en stor nok prøve bak. Dette er et viktig skritt ettersom døde celler er mer sannsynlig å binde seg ikke-spesifikk og bli autofluorescent22,23, noe som ytterligere understreker viktigheten av å velge en metode som konsekvent resulterer i høy celle levedyktighet. Til slutt, når du aspirerer supernatanten, kan pellet ikke alltid være synlig. En liten mengde gjenværende supernatant må stå igjen for å sikre at prøven ikke kastes ved et uhell.
Det er fordeler og ulemper ved å fikse prøvene. Ikke alle antistoffmarkører er kompatible med fiksering, og begrenser nedstrømsanalysen avhengig av cellepopulasjonene av interesse. Også bruk av altfor konsentrert PFA eller å forlate cellene i fikseringsmiddelet i en lengre periode kan resultere i autofluorescens og falske positive avlesninger, og dermed forvirre resultatene24,25. Ved å bruke en 1% PFA-løsning og minimere eksponeringen av cellene, reduseres sannsynligheten for falske positive avlesninger sterkt. Siden denne prosedyren er detaljert og har mange tidsvariabler, plasserer bruk av friske celler laboratorier under strenge tidsbegrensninger for å sikre at cellene forblir levedyktige. Fiksering bevarer cellestrukturen for neste dagsanalyse.
Encellet analyse kan gi viktig innsikt i behandlingseffekt, cellefunksjon og sykdoms- eller behandlingsmekanismer. Eksempler på metoder inkluderer encellet DNA og RNA-sekvensering 26,27, cytometri ved flytid22,28, strømningscytometri og immunhiistokjemi. Med encellet mRNA-sekvensering kan genuttrykk på tidspunktet for utvalgsinnsamling gi celletypespesifikk innsikt26. For eksempel utførte en forskningsgruppe encellet RNA-sekvensering på D1- og D2-dopaminreseptorer som uttrykker middels spiny neuron subtyper fra dorsomedial striatum27. Gruppen omdefinerte transkripsjonen av middels spiny nevroner ved å oppdage nye subtypespesifikke markørgener og identifisere gener som tidligere og feilaktig ble rapportert å være differensialt uttrykt på grunn av mangel på encellet oppløsning27. Ho et al. fremhevet potensialet for encellet RNA-sekvensering ved å oppdage celletypespesifikke legemiddelmål27. Med encellet DNA-sekvensering kan endringer i genuttrykk beskrives ved å måle DNA- og histonemodifikasjoner, kromatintilgjengelighet og kromatinkonformasjon26. Ved måling av enkeltkjerne-DNA-metylering konstruerte Liu et al. et encellet DNA-metylomatlas med 45 musehjerneregioner og identifiserte 161 nevroncelletyper29. Prøvepreparering for encellet sekvensering er mer intrikat, spesielt isolering av enkeltceller og fjerning av rusk. Mattei et al. undersøkte effekten av enzymatisk og mekanisk dissosiasjon på transkripsjons- og proteotypeprofilering, og bemerket at nevrale dissosiasjonsmetoder iboende introduserer et nivå av bias30. Flere grupper har merket seg viktigheten av å jobbe effektivt, dissekere på is og bruke transkripsjonshemmere 26,30,31. Mattei et al. identifiserte også berørte gener og proteiner for å informere analyse30. Imidlertid gir disse teknikkene fortsatt detaljert innsikt i cellulære byggeklosser som er uovertruffen av bulkvevstranskripsjonsomikk26,27.
Flowcytometri er et kraftig analyseverktøy som samtidig kan identifisere og måle parametere for encellede populasjoner ved hjelp av fluorescerende sonder. Noen anvendelser av strømningscytometere inkluderer cellesyklusanalyse, cellesortering, levedyktighet, fenotyping, celleproliferasjon og funksjonelle analyser32,33. De fleste av disse bruksområdene bruker overflatefarging på grunn av tilgjengeligheten av celleoverflateproteiner. Disse proteinene kan farges for å identifisere spesifikke cellepopulasjoner basert på avstamning, utviklingsstadium og funksjon 19,32,33. Prøver kan for eksempel overflateflekkes for å identifisere populasjoner av astrocytter, endotelceller, nevronale forløperceller og mikroglia34. En hovedfordel ved farging av overflateproteiner av levende celler er å kunne sortere cellene samtidig som de beholder muligheten til å utføre ytterligere nedstrømsanalyse34. Mens overflatefargingsteknikker er ganske standard, er intracellulær farging en mer delikat prosedyre. Med intracellulær strømningscytometri må cellene festes og gjennomsyres før farging for å tillate antistoffet å krysse cellemembranen 20,32,33,34. Ideelt sett vil cellemorfologien forbli intakt; Permeabilisering risikerer imidlertid protein denaturering, noe som vil påvirke antistoffdeteksjonennegativt 22,34. Noen metoder for videre nedstrømsanalyse er ikke lenger et alternativ når cellene er fikset20. Mens ulempene med intracellulær farging er mer uttalt enn overflatefarging, tillater førstnevnte deteksjon og analyse av intracellulære molekyler som ellers ikke ville være troverdige. I tillegg kan celleoverflate og intracellulære fargingsprosedyrer kobles sammen for å definitivt identifisere visse celletyper eller vurdere flere parametere samtidig 20,28,34.
Det finnes flere metoder for nevral dissosiasjon som kan brukes til å forberede encellet suspensjon som kreves for cellulær analyse, selv om de ikke er like effektive. Sammenlignet med standardiserte sett og de nevnte teknikkene, er denne spesielle metoden for nevral dissosiasjon beregnet for behandling av små mengder vev, gir en svært levedyktig encellet suspensjon (>90%), og effektiviserer eksperimentet. Med denne protokollen er andre laboratorier utstyrt for å utføre nevral dissosiasjon på en pålitelig og reproduserbar måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Aimee Rogers for å ha gitt praktisk opplæring og fortsatt produktstøtte. Vi takker Dr. Amanda Burke for pågående feilsøking og avklaring av diskusjoner. Vi takker Meredith Joheim og UAMS Science Communication Group for grammatisk redigering og formatering av dette manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH R25GM083247 og NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
