Denne nevrale celledissosiasjonsprotokollen er beregnet på prøver med lav mengde startmateriale og gir en svært levedyktig encellet suspensjon for nedstrømsanalyse, med valgfrie fikserings- og fargingstrinn.
Denne nevrale dissosiasjonsprotokollen (en tilpasning av protokollen som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett) optimaliserer vevsbehandling som forberedelse til detaljert nedstrømsanalyse som strømningscytometri eller encellet sekvensering. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel bruk av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av disse. Den delikate naturen til nevronceller kan komplisere innsatsen for å oppnå den svært levedyktige, sanne encellede suspensjonen med minimal cellulært rusk som kreves for encellet analyse. Dataene viser at denne kombinasjonen av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse konsekvent gir en svært levedyktig (>90%) encellet suspensjon, og overvinner de nevnte vanskelighetene. Selv om noen få av trinnene krever manuell fingerferdighet, reduserer disse trinnene prøvehåndtering og potensielt celletap. Dette manuskriptet beskriver hvert trinn i prosessen for å utstyre andre laboratorier for å lykkes med å fjerne små mengder nevralt vev som forberedelse til nedstrømsanalyse.
Hippocampus ble først beskrevet av en bolognesisk anatomist, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-1. Ved å navngi denne nyvunne strukturen ble Aranzio sannsynligvis inspirert av sin uhyggelige likhet med sjøhesten til slekten Hippocampus1. Hippocampus er involvert i stressresponser, men er allment kjent for sin rolle i læring og hukommelse. Mer spesifikt er hippocampus ansvarlig for koding og gjenfinning av deklarativt og romlig minne1.
Hippocampus, eller hippocampus riktig, er delt inn i CA1 (cornu ammonis), CA2 og CA3 underfelt1. Sammenlignet med resten av nervesystemet har hippocampus flere unike definerende egenskaper, inkludert plastisitet og potensial for pågående nevrogenese2. Neurogenese er prosessen med spredning og differensiering av nevrale stamceller, etterfulgt av deres integrasjon i det eksisterende nevronale nettverket. Neurogenese er begrenset til den subgranulære sonen av dentate gyrus og subventrikulær sone av laterale ventrikler (og olfaktoriske pærer)3. Mens neurogenese er rikelig i embryogenese, er det en livslang prosess 3,4. Som sådan vil denne diskusjonen fokusere på voksen neurogenese i hippocampus.
De subventrikulære og subgranulære sonene er nevrogene nisjer som inneholder ependymale og vaskulære celler, samt umodne og modne avstamninger av nevrale stamceller5. Mikroglia bidrar til disse nisjene som immunceller for å regulere nevrogenese6. Nevrale stamceller er nonstem celleavkom av nevrale stamceller7. Tre typer nevrale forfedre er til stede i den subventrikulære sonen: radial glia-lignende type B-celler, type C transittforsterkningsforsterkere og type A nevroblaster 3,8. De langsomt delte type B nevrale stamceller i den subventrikulære sonen kan skille seg ut i raskt å dele type C-celler8. Deretter skiller C-celler seg ut i type A-cellene8. Disse nevroblaster migrerer gjennom rostral migrasjonsstrømmen til den olfaktoriske pæren før de differensierer til interneuroner eller oligodendrocytter9. Disse olfaktoriske pære internurons er nøkkelen til olfaktorisk kortsiktig minne, og assosiativ læring, mens oligodendrocytter myelinate axoner av corpus callosum9. Flertallet av voksen neurogenese forekommer i den subgranulære sonen av dentate gyrus, hvor radial type 1 og ikke-radioell type 2 nevrale forfedre er funnet3. De fleste nevrale stamceller er bestemt til å bli dentate granulat nevroner og astrocytter10. Forbundet med gapkryss danner astrocytter nettverk for å modulere plastisitet, synaptisk aktivitet og nevronal spenning5. Som den primære eksitatoriske nevronen i dentate gyrus gir granulatceller innspill fra entorhinal cortex til CA3-regionen11.
Nevrale stamcellepopulasjoner kan isoleres ved hjelp av immunomgnetiske eller immunfluoreserende isolasjonsstrategier12,13. Nevralt vev er spesielt vanskelig å dissosiere; forsøk på å gjøre dette resulterer ofte i prøver med dårlig celle levedyktighet og / eller unnlater å produsere den nødvendige encellede suspensjonen for nedstrømsanalyse. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel ved hjelp av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av teknikker14,15. I en studie som evaluerte nevrale dissosiasjonsmetoder, ble levedyktigheten og kvaliteten på manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturering versus kombinasjoner av pipettetrianturering og fordøyelse med ulike enzymer sammenlignetmed 15. Kvaliteten ble gradert basert på mengden celleklumper og DNA eller subcellulært rusk i den tilberedte suspensjonen15. Suspensjoner av glial svulster utsatt for manuell mekanisk dissosiasjon alene hadde betydelig lavere celle levedyktighet enn behandlinger med dispase eller en kombinasjon av DNase, kollagenase og hyaluronidase15. Volovitz et al. anerkjente variasjonen i levedyktighet og kvalitet mellom de ulike metodene og understreket at utilstrekkelig dissosiasjon kan redusere nøyaktigheten av nedstrømsanalyse15.
I en egen studie sammenlignet forfatterne over 60 forskjellige metoder og kombinasjoner av dissosiasjon av dyrkede nevronceller14. Disse metodene inkluderte åtte forskjellige variasjoner av manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturasjon, en sammenligning av inkubasjon med fem individuelle enzymer med tre forskjellige intervaller, og ulike kombinasjoner av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse eller kombinasjonen av to enzymer14. Ingen av de mekaniske metodene ga en encellet suspensjon14. Fire av de enkle enzymbehandlingene, ti av kombinasjonen enzymatiske behandlinger og fire av kombinasjonene av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse ga en encellet suspensjon14. Enzymatisk fordøyelse med TrypLE etterfulgt av Trypsin-EDTA dissosierte prøver14. For øvrig hadde prøver behandlet med TrypLE og/eller Trypsin-EDTA en tendens til å danne gelatinøse klumper14. Mens denne studien ble utført på dyrkede celler, snakker den til manglene ved pipettetrianturering eller enzymatisk fordøyelse alene.
Side-ved-side sammenligninger av manuell versus automatisert mekanisk dissosiasjon mangler. Imidlertid kjørte en gruppe flowcytometri for å sammenligne manuell og halvautomatisk mekanisk dissosiasjon av hele musehjerner i forbindelse med kommersiell papain eller trypsin enzymatisk dissosiasjonssett16. Behandling med dissosiatoren ga mer konsekvent levedyktige celler16. Etter dissosiasjon isolerte forfatterne også Prominin-1 celler, nevronale forløperceller og mikroglia16. For to av de tre isolerte cellepopulasjonene var renheten til de isolerte cellene litt høyere når prøver ble behandlet med dissociatoren, sammenlignet med manuelt16. Reiß et al. bemerket at person-til-person variabilitet i pipetteringsteknikk hindrer reproduserbarhet av levedyktig cellepopulasjonsutbytte i vevsdissosiasjon16. Forfatterne konkluderte med at automatisert mekanisk dissosiasjon standardiserer prøvebehandling16.
Metoden for dissosiasjon skissert i dette manuskriptet er en kombinasjon av helautomatisk mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse, ved hjelp av løsninger som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett17. I motsetning til standardprotokoller reduserer denne optimaliserte protokollen prøvemanipulering, gir en svært levedyktig encellet suspensjon, og er ment for behandling av minimale mengder startvev.
Flere trinn i denne nevrale dissosiasjonsprotokollen krever dyktig teknikk og fingerferdighet-perfusjon, supernatant aspirasjon og myelinfjerning. Gjennom perfusjonsprosessen må de indre organene forbli intakte (bortsett fra å fjerne membranen og klippe hjertet); Dette inkluderer å unngå hjertets øvre kamre med sommerfuglnålen. Mens mengden saltvann med heparin som trengs varierer, indikerer gjennomsiktig væske som strømmer fra hjertet at prosessen er fullført. Hjernen må være helt og riktig perfundert, og da …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Aimee Rogers for å ha gitt praktisk opplæring og fortsatt produktstøtte. Vi takker Dr. Amanda Burke for pågående feilsøking og avklaring av diskusjoner. Vi takker Meredith Joheim og UAMS Science Communication Group for grammatisk redigering og formatering av dette manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH R25GM083247 og NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
BD LSRFortessa | BD | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |