Summary

Kombinert mekanisk og enzymatisk dissosiasjon av mus hjerne hippocampal vev

Published: October 21, 2021
doi:

Summary

Denne nevrale celledissosiasjonsprotokollen er beregnet på prøver med lav mengde startmateriale og gir en svært levedyktig encellet suspensjon for nedstrømsanalyse, med valgfrie fikserings- og fargingstrinn.

Abstract

Denne nevrale dissosiasjonsprotokollen (en tilpasning av protokollen som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett) optimaliserer vevsbehandling som forberedelse til detaljert nedstrømsanalyse som strømningscytometri eller encellet sekvensering. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel bruk av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av disse. Den delikate naturen til nevronceller kan komplisere innsatsen for å oppnå den svært levedyktige, sanne encellede suspensjonen med minimal cellulært rusk som kreves for encellet analyse. Dataene viser at denne kombinasjonen av automatisert mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse konsekvent gir en svært levedyktig (>90%) encellet suspensjon, og overvinner de nevnte vanskelighetene. Selv om noen få av trinnene krever manuell fingerferdighet, reduserer disse trinnene prøvehåndtering og potensielt celletap. Dette manuskriptet beskriver hvert trinn i prosessen for å utstyre andre laboratorier for å lykkes med å fjerne små mengder nevralt vev som forberedelse til nedstrømsanalyse.

Introduction

Hippocampus ble først beskrevet av en bolognesisk anatomist, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-1. Ved å navngi denne nyvunne strukturen ble Aranzio sannsynligvis inspirert av sin uhyggelige likhet med sjøhesten til slekten Hippocampus1. Hippocampus er involvert i stressresponser, men er allment kjent for sin rolle i læring og hukommelse. Mer spesifikt er hippocampus ansvarlig for koding og gjenfinning av deklarativt og romlig minne1.

Hippocampus, eller hippocampus riktig, er delt inn i CA1 (cornu ammonis), CA2 og CA3 underfelt1. Sammenlignet med resten av nervesystemet har hippocampus flere unike definerende egenskaper, inkludert plastisitet og potensial for pågående nevrogenese2. Neurogenese er prosessen med spredning og differensiering av nevrale stamceller, etterfulgt av deres integrasjon i det eksisterende nevronale nettverket. Neurogenese er begrenset til den subgranulære sonen av dentate gyrus og subventrikulær sone av laterale ventrikler (og olfaktoriske pærer)3. Mens neurogenese er rikelig i embryogenese, er det en livslang prosess 3,4. Som sådan vil denne diskusjonen fokusere på voksen neurogenese i hippocampus.

De subventrikulære og subgranulære sonene er nevrogene nisjer som inneholder ependymale og vaskulære celler, samt umodne og modne avstamninger av nevrale stamceller5. Mikroglia bidrar til disse nisjene som immunceller for å regulere nevrogenese6. Nevrale stamceller er nonstem celleavkom av nevrale stamceller7. Tre typer nevrale forfedre er til stede i den subventrikulære sonen: radial glia-lignende type B-celler, type C transittforsterkningsforsterkere og type A nevroblaster 3,8. De langsomt delte type B nevrale stamceller i den subventrikulære sonen kan skille seg ut i raskt å dele type C-celler8. Deretter skiller C-celler seg ut i type A-cellene8. Disse nevroblaster migrerer gjennom rostral migrasjonsstrømmen til den olfaktoriske pæren før de differensierer til interneuroner eller oligodendrocytter9. Disse olfaktoriske pære internurons er nøkkelen til olfaktorisk kortsiktig minne, og assosiativ læring, mens oligodendrocytter myelinate axoner av corpus callosum9. Flertallet av voksen neurogenese forekommer i den subgranulære sonen av dentate gyrus, hvor radial type 1 og ikke-radioell type 2 nevrale forfedre er funnet3. De fleste nevrale stamceller er bestemt til å bli dentate granulat nevroner og astrocytter10. Forbundet med gapkryss danner astrocytter nettverk for å modulere plastisitet, synaptisk aktivitet og nevronal spenning5. Som den primære eksitatoriske nevronen i dentate gyrus gir granulatceller innspill fra entorhinal cortex til CA3-regionen11.

Nevrale stamcellepopulasjoner kan isoleres ved hjelp av immunomgnetiske eller immunfluoreserende isolasjonsstrategier12,13. Nevralt vev er spesielt vanskelig å dissosiere; forsøk på å gjøre dette resulterer ofte i prøver med dårlig celle levedyktighet og / eller unnlater å produsere den nødvendige encellede suspensjonen for nedstrømsanalyse. Nevral dissosiasjon kan utføres via mekanisk dissosiasjon (for eksempel ved hjelp av filtre, hakketeknikker eller pipettetrianturering), enzymatisk fordøyelse eller en kombinasjon av teknikker14,15. I en studie som evaluerte nevrale dissosiasjonsmetoder, ble levedyktigheten og kvaliteten på manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturering versus kombinasjoner av pipettetrianturering og fordøyelse med ulike enzymer sammenlignetmed 15. Kvaliteten ble gradert basert på mengden celleklumper og DNA eller subcellulært rusk i den tilberedte suspensjonen15. Suspensjoner av glial svulster utsatt for manuell mekanisk dissosiasjon alene hadde betydelig lavere celle levedyktighet enn behandlinger med dispase eller en kombinasjon av DNase, kollagenase og hyaluronidase15. Volovitz et al. anerkjente variasjonen i levedyktighet og kvalitet mellom de ulike metodene og understreket at utilstrekkelig dissosiasjon kan redusere nøyaktigheten av nedstrømsanalyse15.

I en egen studie sammenlignet forfatterne over 60 forskjellige metoder og kombinasjoner av dissosiasjon av dyrkede nevronceller14. Disse metodene inkluderte åtte forskjellige variasjoner av manuell mekanisk dissosiasjon ved pipettetrianturasjon, en sammenligning av inkubasjon med fem individuelle enzymer med tre forskjellige intervaller, og ulike kombinasjoner av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse eller kombinasjonen av to enzymer14. Ingen av de mekaniske metodene ga en encellet suspensjon14. Fire av de enkle enzymbehandlingene, ti av kombinasjonen enzymatiske behandlinger og fire av kombinasjonene av mekanisk dissosiasjon med enzymatisk fordøyelse ga en encellet suspensjon14. Enzymatisk fordøyelse med TrypLE etterfulgt av Trypsin-EDTA dissosierte prøver14. For øvrig hadde prøver behandlet med TrypLE og/eller Trypsin-EDTA en tendens til å danne gelatinøse klumper14. Mens denne studien ble utført på dyrkede celler, snakker den til manglene ved pipettetrianturering eller enzymatisk fordøyelse alene.

Side-ved-side sammenligninger av manuell versus automatisert mekanisk dissosiasjon mangler. Imidlertid kjørte en gruppe flowcytometri for å sammenligne manuell og halvautomatisk mekanisk dissosiasjon av hele musehjerner i forbindelse med kommersiell papain eller trypsin enzymatisk dissosiasjonssett16. Behandling med dissosiatoren ga mer konsekvent levedyktige celler16. Etter dissosiasjon isolerte forfatterne også Prominin-1 celler, nevronale forløperceller og mikroglia16. For to av de tre isolerte cellepopulasjonene var renheten til de isolerte cellene litt høyere når prøver ble behandlet med dissociatoren, sammenlignet med manuelt16. Reiß et al. bemerket at person-til-person variabilitet i pipetteringsteknikk hindrer reproduserbarhet av levedyktig cellepopulasjonsutbytte i vevsdissosiasjon16. Forfatterne konkluderte med at automatisert mekanisk dissosiasjon standardiserer prøvebehandling16.

Metoden for dissosiasjon skissert i dette manuskriptet er en kombinasjon av helautomatisk mekanisk dissosiasjon og enzymatisk fordøyelse, ved hjelp av løsninger som følger med et kommersielt voksen hjernedissosiasjonssett17. I motsetning til standardprotokoller reduserer denne optimaliserte protokollen prøvemanipulering, gir en svært levedyktig encellet suspensjon, og er ment for behandling av minimale mengder startvev.

Protocol

Eksperimenter ble utført i samsvar med de etiske standardene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved UAMS. 6 måneder gamle kvinnelige C57Bl6/J villmus ble kjøpt og gruppehus (4 mus per bur) under en konstant 12 timers lys / mørk syklus. 1. Utarbeidelse av reagenser Forbered fikserbar live / død flekk lagerløsning. Rekonstituer fluorescerende flekk med 20 μL dimetylsulfoksid (DMSO). Pakk hetteglasset i folie, merk det som “Rekonstituert”, og oppbev…

Representative Results

Prøver ble behandlet med et strømningscytometer ved et kjerneanlegg, og de resulterende dataene ble evaluert med en programvarepakke for strømningsanalyse. Tidligere ble kompensasjonskontroller analysert – levende / død flekk og negativ kontroll. Hvis flere fluorokromer brukes, bør fluorescens minus en (FMO) kontroller og enkeltflekkkontroller fremstilles for hvert antistoff. Kompensasjon for spektral overlapping for eksperimentelle prøver ble beregnet basert på de analyserte kontrollene. For identifikasjon av cel…

Discussion

Flere trinn i denne nevrale dissosiasjonsprotokollen krever dyktig teknikk og fingerferdighet-perfusjon, supernatant aspirasjon og myelinfjerning. Gjennom perfusjonsprosessen må de indre organene forbli intakte (bortsett fra å fjerne membranen og klippe hjertet); Dette inkluderer å unngå hjertets øvre kamre med sommerfuglnålen. Mens mengden saltvann med heparin som trengs varierer, indikerer gjennomsiktig væske som strømmer fra hjertet at prosessen er fullført. Hjernen må være helt og riktig perfundert, og da …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Aimee Rogers for å ha gitt praktisk opplæring og fortsatt produktstøtte. Vi takker Dr. Amanda Burke for pågående feilsøking og avklaring av diskusjoner. Vi takker Meredith Joheim og UAMS Science Communication Group for grammatisk redigering og formatering av dette manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH R25GM083247 og NIH 1R01CA258673 (A.R.A).

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 02-682-003 Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes Becton Dickinson Labware Europe 352009 Polystyrene
25 mL Serological Pipets Fisher Scientific 14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Falcon 352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System Corning 431097
70 μm cell strainer Fisher Scientific 08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit Miltenyi Biotec  130-107-677 Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein Sigma-Aldrich M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B Miltenyi Biotec 130-117-394
BD LSRFortessa BD
BSA Sigma-Aldrich A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 Miltenyi Biotec 130-113-810
CD31 Antibody Miltenyi Biotec 130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer Fisher Scientific 11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231-100
Ethanol Pharmco by Greenfield Global 111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14060-09 Perfusion
FlowJo BD (v10.7.0)
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Gibco DPBS (1X) ThermoFisher Scientific 14190144
Glass Beaker Fisher Scientific 02-555-25A
Heparin sodium Fresenius Kabi 504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher L34965
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-51
Noyes Spring Scissors Fine Science Tools 15012-12 Dissection
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 441244-3KG Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 Rainin 30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 Rainin 30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 Rainin 30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) Rainin 30386597
RBXMO FITC XADS Fisher Scientific A16167
Round Ice Bucket with Lid Fisher Scientific 07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap Falcon 100-0087
S1 Pipet Fillers ThermoFisher Scientific 9541
Spatula & Probe Fine Science Tools 10090-13 Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" Termuno SV-23BLK Butterfly needle
Test Tube Rack Fisher Scientific 14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge ThermoFisher discontinued Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump Fisher Scientific 13-876-2 Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice Kent Scientific VetFlo-MSEKIT Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System Kent Scientific VetFlo-1210S 0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer Beckman Coulter Life Sciences 731196 Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials Beckman Coulter Life Sciences 383721 Cell Counting

References

  1. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O’Keefe, J. . The Hippocampus Book. , (2007).
  2. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
  3. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
  5. Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
  6. Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
  7. Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
  8. Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
  9. Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
  10. Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
  11. Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, 137-145 (2015).
  12. Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
  13. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
  14. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
  15. Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020)
  16. Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021)
  17. Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
  18. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
  19. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
  20. Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
  21. Recommended controls for flow cytometry. Abcam Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021)
  22. . Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021)
  23. Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
  24. Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
  25. Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
  26. Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
  27. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
  28. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
  29. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  30. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
  31. O’Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
  32. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).

Play Video

Cite This Article
Trujillo, M., McElroy, T., Brown, T., Simmons, P., Ntagwabira, F., Allen, A. R. Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue. J. Vis. Exp. (176), e63007, doi:10.3791/63007 (2021).

View Video