Login processing...

Journal / Neuroscience /

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Neuroscience

Kombineret mekanisk og enzymatisk dissociation af musehjernens hippocampale væv

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Journal (Neuroscience)

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Journal (Neuroscience)

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Click here for the English version

Kombineret mekanisk og enzymatisk dissociation af musehjernens hippocampale væv

Article DOI: 10.3791/63007-v • 07:14 min

October 21st, 2021 •

Madison Trujillo^1,2,3, Taylor McElroy^1,2,3, Taurean Brown^1,2,3, Pilar Simmons^1,2, Fabio Ntagwabira^1,2,3, Antiño R. Allen^1,2,3

¹Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, ²Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, ³Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 21st, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne neurale celle dissociationsprotokol er beregnet til prøver med en lav mængde udgangsmateriale og giver en meget levedygtig enkeltcellesuspension til downstream-analyse med valgfri fikserings- og farvningstrin.

Transcript

Succesfuld dissociering af små mængder neuralt væv kan udstyre laboratorier til at få strukturspecifik indsigt i behandlingseffektivitet, cellulær funktion samt sygdoms- og behandlingsmekanismer. Denne neurale dissociationsprotokol giver konsekvent en meget levedygtig og faktisk enkeltcellesuspension. Derudover kan vi behandle prøver, der kun er en brøkdel af dem, som de kommercielle kits er beregnet til.

Korrekt planlægning og forberedelse er nøglen til et vellykket resultat for denne teknik. At køre flere øvelsesrunder for at gøre dig bekendt med protokollen ville være gavnligt. Efter bedæstelse af en seks måneder gammel kvindelig C57BL / 6J mus, klem underlivet og løft huden ved hjælp af tang.

Brug derefter en saks til at skære gennem pelsen og huden til bunden af brystkassen. Lav to diagonale snit, der begynder under brystkassen og bevæger sig mod hver skulder. Derefter sekteres membranen og brystkassen forsigtigt igen for at udsætte hjertet.

Når du forsigtigt har fjernet bindevæv omkring hjertet, skal du bruge en saks til at klippe det højre atrium. Sluk derefter isofluranstrømmen til udluftningen. Hold hjertet stabilt med tang og med sommerfuglnålens skråning vendt op, gennembor venstre ventrikel, mens nålen holdes i niveau og parallel med dyret.

Hold derefter nålen på plads, tænd pumpen og perfus mindst 30 ml saltvand eller heparinopløsning, indtil væsken, der forlader hjertet, er uigennemsigtig og leveren og lungerne blegner i farven. Efter perfusion skal du slukke for pumpen, fjerne nålen og overføre musen til dissektionsområdet. Efter halshugning skal du skære pelsen fra bagsiden af hovedet op til øjnene og skrælle huden tilbage for at udsætte kraniet.

Klip derefter kraniet mellem øjnene og lav to snit bag på kraniet ved 10 og 2 o'clock positioner. Lav derefter et langt snit langs kraniets midterste linje til det oprindelige snit mellem øjnene. Derefter skal du bruge tang til at skrælle de to halvdele af kraniet væk til siderne.

Brug derefter en spatel til at fjerne hjernen og læg den i en 60 millimeter glas petriskål fyldt med kold DPBS og opbevaret på is. Brug en skalpel eller barbermaskine til at adskille hver halvkugle og fjerne de olfaktoriske pærer og cerebellum. Fjern derefter midterhjernen, indtil hippocampus er udsat.

Fastgør derefter hjernen med tang. Brug derefter et andet sæt tang til forsigtigt at drille hippocampus ud af hver halvkugle. Overfør begge hippocampi til et mærket 1,5 ml rør indeholdende kold DPBS og læg røret på is.

Brug tang til at overføre hippocampi-vævsstykkerne til et C-rør og tilsæt 30 mikroliter enzymblanding 2 i røret. Når du har drejet hætten og strammet, indtil den klikker, skal du placere røret i en dissociator og køre det relevante program. Mens programmet kører, forvædes en 70 mikron cellesil placeret på et 50 ml konisk rør med to milliliter BSA-buffer.

Når dissociationsprogrammet er afsluttet, tilsættes fire milliliter BSA-buffer til det dissocierede væv og filtrerer blandingen gennem cellesilen på det 50 ml koniske rør. Derefter tilsættes 10 ml DPBS til C-røret. Luk derefter røret, hvirvl opløsningen forsigtigt, og filtrer den gennem cellesilen på det 50 ml koniske rør.

Centrifugering af den filtrerede cellesuspension, kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten og opbevar pelleten. Til fjernelse af snavs skal pelleten genanvendes med 1.550 mikroliter kold DPBS og overføre suspensionen til et mærket 50 ml konisk rør. Tilsæt derefter 450 mikroliter opløsning til fjernelse af koldt affald og pipette op og ned.

Overlejr forsigtigt celleophænget med en milliliter kold DPBS, og hold spidsen mod væggen i det koniske rør. Gentag proceduren, indtil det samlede overlay er to milliliter. Centrifuger derefter suspensionen ved 3.000 gange G i 10 minutter med fuld acceleration og fuld pause.

Aspirer det øverste lag, og fej derefter pipettespidsen frem og tilbage for at aspirere det hvide mellemlag. Fjern så meget af mellemlaget som muligt uden at forstyrre det nederste lag. Tilsæt derefter to milliliter kold DPBS og pipette op og ned for at blande.

Centrifuger derefter suspensionen ved 1.000 gange G i 10 minutter med fuld acceleration og fuld pause. Efter centrifugering kasseres supernatanten og suspenderes pelleten igen i en milliliter BSA-buffer. Efter celletælling centrifugeres den resterende cellesuspension og suspenderes pelleten igen i 50 mikroliter fortyndet levende død plet.

Overfør derefter prøven til et mærket flowrør og inkuber ved stuetemperatur i 8 til 10 minutter i mørket. Efter inkubation tilsættes 500 mikroliter BSA-buffer og gentages centrifugeringstrinnet. Kassér derefter supernatanten og efterlad en lille mængde buffer i røret.

Den primære port udelukkede snavs i de forreste scatter versus side scatter plots, og de døde celler blev efterfølgende udelukket. Den anden port udelukkede celler, der var positive for myelin basisk protein. Og af de resterende celler blev der skabt tæthedsplotter af celler, der var positive for hver fluorokrom.

Frekvensen af hver neuronal cellepopulation blev beregnet ud fra den tredje port. Prøver behandlet med manuel mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse gav en væsentligt lavere population af celler af interesse, mens både friske og faste prøver behandlet med automatiseret mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse viste en flere gange højere population af celler af interesse. Mens perfusions- og affaldsfjernelsestrinnene kan være udfordrende i starten, kan opretholdelse af en jævn og stabil hånd hjælpe med at sikre succes.

X

Simple Hit Counter