Immunology and Infection
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狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析
Chapters
Summary June 8th, 2022
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本プロトコールは、マウスにおけるループス進行を追跡する方法を記載する。腎臓における細胞浸潤およびタンパク質沈着に基づいて狼瘡腎炎を特徴付けるために、2つの追加の手順が提示される。
Transcript
これらの方法は、狼瘡患者の腎臓に関連する慢性炎症の進行を調査するのに役立ちます。私たちは、狼瘡の病気の経過を監視するために使用できる、信頼性が高く費用効果の高い代替手段を提供しています。70%エタノールをスプレーしてフードの滅菌を開始し、表面に滅菌プラスチックシートを置きます。
次に、チップ、1.5ミリリットルのチューブ、ピペットを準備して、約20マイクロリットルの尿を収集します。ケージを取り、フードの中に置く前に70%エタノールをスプレーします。その後、片手でマウスを持ち、もう一方の手で腹側を上から下に優しくマッサージします。
1.5ミリリットルのチューブまたはピペットを使用して、尿を直接収集します。またはサンプル滴がプラスチックシートからそれを集めるならば。次に、マウスをケージに戻します。
解剖した腎臓を粒度に切断し、HEPESを含むRPMI 1640培地中のコラゲナーゼおよびDNase 1を含む5ミリリットルの消化バッファーで、摂氏37度で継続的に穏やかに振とうしながら1時間消化します。10ミリモルのEDTAを含む10ミリリットルの氷冷PBSを加え、氷上で10分間インキュベートします。次に、サスペンションを2回ボルテックスします。
その後、細胞懸濁液を100マイクロメートルのストレーナーでろ過し、10ミリリットルのHBSSフルで洗浄します。その後、室温で10分間、350倍Gで遠心分離する。30%、37、70%ストックの等張パーコール溶液を調製し、70%溶液の上に37%パーコール溶液の層を追加します。
細胞を5ミリリットルの30%ストック等張パーコールに再懸濁します。パスツールピペットを使用して、上部5ミリリットルの37%、下部に5ミリリットルの70%をゆっくりとロードし、ストック等張パーコールグラジエントを作成します。その後、室温で1000倍Gでアップナンバー9、ダウンナンバー0で30分間遠心分離する。
その後、37〜70%の界面から白血球を収集し、5ミリリットルのC 10に再懸濁します。ここでも、摂氏4度で10分間、350倍Gで遠心分離します。続いて、細胞ペレットを3ミリリットルのファックス緩衝液に再懸濁し、摂氏4度で5分間、350倍Gで遠心分離する。
次に、上清を廃棄し、全容量の約50マイクロリットルを残します。チューブあたり50マイクロリットルのFC受容体ブロックを追加します。この混合に続いて、暗所で氷上で10分間インキュベートする。
後で、洗浄用に2ミリリットルのファックスバッファーを追加します。その後、摂氏4度で5分間Gの350倍で遠心分離し、全量の約50マイクロリットルを残して上清を廃棄する。次に、適切な蛍光色素を20マイクロリットル加え、氷上で15〜30分間放置します。
CD 138ブリリアントバイオレットセブン11とCD 45 Alexa Fluor 700を含むチューブあたり50マイクロリットルの抗体ミックスを加え、氷上で暗闇の中で15〜30分間インキュベートします。その後、3 ミリリットルの FAX バッファーを追加します。摂氏4度で5分間、350倍Gで遠心分離します。
全量の約50マイクロリットルを残して真空により上清を除去する。その後、細胞ペレットを200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。サンプルを収集するには、最適な切断温度コンパウンドを含む小さなプラスチッククライオモールドにハーフ腎臓を埋め込みます。
次に、発泡スチロールの箱にドライアイスを加え、ドライアイスの上にクライオモールドを慎重に置きます。次に、クライオモールドを取り出し、アルミホイルで包み、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管します。次に、乾燥した部分を冷たいアセトンで4マイクロメートルの切片に10分間固定します。
スライドを固定した後、0.5〜1時間風乾し、マイナス20°Cで短時間、マイナス80°Cで長時間保管します。サンプルを染色するには、スライドを冷たいアセトンで5〜10分間再固定し、切片を室温まで温めます。その後、パットペンを使用して、セクションの周りに疎水性の円を描き、乾燥させます。
次に、TBSのコープランドジャーにスライドを20分間置き、ジャーをシェーカーに置いて静かに振とうします。続いて、TBSを注ぎ、TBS 5%BSAと0.1%TW 20で瓶を満たします。その後、シェーカーで静かに振って瓶を20分間インキュベートします。
次に、スライドを取り出し、スライドの下部を拭きます。100マイクロリットルのコンジュゲート抗体C3フィットCおよびIgG2 APEを切片に加え、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。切片をPBS 5%BSAと0.1%TW 20で10分間シェーカーで3回洗浄し、スライドを振って乾かします。
セクションを退色防止試薬で取り付け、次にカバースリップで取り付けます。次に、顕微鏡で見るまでスライドを摂氏4度で保管します。画像Jソフトウェアを使用した画像解析では、目的の領域の輪郭を描きます。
その後、分析をクリックして標準パラメータを設定し、測定値と測定面積を設定して結果を取得します。次に、メジャーウィンドウから取得したデータをスプレッドシートに転送します。完了したら、[分析]をクリックして領域を測定し、データを前のスプレッドシートに再度転送します。
MRL LPRマウスの尿中のタンパク質レベルは、対照群としてリン酸緩衝生理食塩水、治療群として乳酸菌ロイテリで処理した場合に経時的に検出されました。L.reuteriで処置したマウス群は、対照群よりもより積極的なタンパク尿進行であった。形質細胞を分析するために単離された腎臓白血球についてファックス分析を行った。
さらに、マウスを、エシェリヒア・コリ二本鎖DNAと共にバンコマイシンまたはバンコマイシンで処理した。大腸菌二本鎖DNAは腎浸潤を引き起こすと予想されたが、形質細胞の割合に有意差は見られなかった。補体C3およびIgG2aは、女性のMRL IPR腎臓切片の免疫蛍光染色によって検出されました。
C3およびIgG2aの腎沈着に及ぼす有効な環境因子を、動物施設の自家マウスパンと販売業者から購入したマウスパンについて比較した。免疫組織化学的分析では、2つのグループ間に差は示されませんでした。パーセンテージストックISO 20 Percollソリューションの各レイヤーを追加するのは難しい場合があり、それらが混在している場合は、最初からやり直す必要があります。
この手順は、フローサイトメーターやビッター実験に役立つため、さまざまな腎細胞タイプの集団を研究することはできません。この手順により、腎臓に浸潤するB細胞を研究することができ、文献にはあまり情報がありません。
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