Immunology and Infection
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단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석
Chapters
Summary June 8th, 2022
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본 프로토콜은 마우스에서 루푸스 진행을 추적하는 방법을 기술한다. 세포 침윤과 신장에서의 단백질 침착을 기반으로 루푸스 신염을 특성화하기위한 두 가지 추가 절차가 제시됩니다.
Transcript
이러한 방법은 루푸스 환자의 신장과 관련된 만성 염증의 진행을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 루푸스의 질병 경과를 모니터링하는 데 사용할 수있는 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 대안을 제공하고 있습니다. 70 % 에탄올을 분사하여 후드 살균을 시작하고 표면에 멸균 플라스틱 시트를 놓습니다.
그런 다음 팁, 1.5 밀리리터 튜브 및 피펫을 준비하여 약 20 마이크로 리터의 소변을 수집합니다. 케이지를 가져다가 후드 안에 넣기 전에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 그런 다음 한 손으로 마우스를 잡고 다른 손으로 복부 부위를 위에서 아래로 부드럽게 마사지합니다.
1.5 밀리리터 튜브 또는 피펫을 사용하여 소변을 직접 수집하십시오. 또는 샘플 방울이 플라스틱 시트에서 수집되는 경우. 그런 다음 마우스를 케이지에 다시 넣으십시오.
해부 된 신장을 입자 크기로 자르고 섭씨 37도에서 지속적으로 부드럽게 흔들면서 1 시간 동안 HEPES를 함유 한 RPMI 1640 배지에서 콜라게나제 및 DNase 1을 함유 한 5 밀리리터의 소화 완충액에서 소화합니다. 10 밀리몰의 EDTA를 함유 한 10 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하고 얼음 위에서 10 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 서스펜션을 두 번 소용돌이치십시오.
나중에, 세포 현탁액을 100 마이크로미터 스트레이너를 통해 여과하고, 10 밀리리터의 HBSS로 가득 채웠다. 그 후, 실온에서 10분 동안 350배 G로 원심분리한다. 30, 37 및 70 % 재고 등장 성 Percoll 용액을 준비하고 70 % 용액 위에 37 % Percoll 용액 층을 추가합니다.
세포를 5 밀리리터의 30 % 스톡 등장 성 Percoll에 다시 현탁시킵니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 상단에 5 밀리리터의 37 %를, 하단에 5 밀리리터의 70 %를 천천히 로드하여 스톡 등장성 Percoll 구배를 만듭니다. 그 후, 상온에서 30분 동안 1000배 G에서 위로 9번, 0번을 올리고 아래로 0번을 원심분리한다.
그 후, 37 내지 70%계면에서 백혈구를 수집하고, 이들을 5밀리리터의 C10에 재현탁시킨다. 다시, 섭씨 4도에서 10 분 동안 350 배 G에서 원심 분리합니다. 이어서 세포 펠렛을 3 밀리리터의 팩스 완충액에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 5 분 동안 350 배 G에서 원심 분리합니다.
그런 다음 전체 부피의 약 50 마이크로 리터를 남기고 상청액을 버립니다. 튜브 당 50 마이크로 리터의 FC 수용체 블록을 추가하십시오. 이 믹스를 따라 10 분 동안 어둠 속에서 얼음 위에서 배양하십시오.
나중에 세탁을 위해 2 밀리리터의 팩스 버퍼를 추가하십시오. 이어서, 섭씨 4도에서 5분 동안 350배 G에서 원심분리하고, 전체 부피의 약 50 마이크로리터를 남기고 상청액을 버린다. 다음으로, 20 마이크로 리터의 적절한 형광 염료를 첨가하고 얼음 위에 15-30 분 동안 그대로 두십시오.
CD 138 브릴리언트 바이올렛 세븐 11 및 CD 45 Alexa Fluor 700을 포함하는 튜브당 50 마이크로리터의 항체 혼합물을 추가하고 15 내지 30분 동안 어둠 속에서 얼음 위에서 배양한다. 그런 다음 3밀리리터의 팩스 버퍼를 추가합니다. 섭씨 4도에서 5 분 동안 350 배 G로 원심 분리합니다.
진공에 의해 상청액을 제거하여 총 부피의 약 50 마이크로리터를 남긴다. 이후, 세포 펠렛을 200 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 샘플을 수집하려면 절반의 신장을 최적의 절단 온도 화합물로 작은 플라스틱 저온에 삽입합니다.
그런 다음 폴리스티렌 폼 상자에 드라이 아이스를 넣고 드라이 아이스 위에 극저온을 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 냉동 몰드를 제거하고 알루미늄 호일로 싸서 나중에 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 그런 다음 차가운 아세톤으로 10 분 동안 건조한 것을 4 마이크로 미터 섹션으로 고정하십시오.
슬라이드를 고정한 후 0.5시간에서 1시간 동안 자연 건조하여 영하 20도에서 짧은 시간 동안 또는 영하 80도에서 장기간 보관합니다. 샘플을 염색하려면 슬라이드를 차가운 아세톤에 5-10 분 동안 다시 고정하고 섹션이 실온으로 예열되도록하십시오. 그런 다음 팻 펜을 사용하여 섹션 주위에 소수성 원을 그리고 건조시킵니다.
그런 다음 TBS의 슬라이드를 Copeland 병에 20 분 동안 놓고 병을 통에 올려 부드럽게 흔 듭니다. 그 후, TBS를 붓고 병에 TBS 5 % BSA 및 0.1 % TW 20을 채 웁니다. 나중에 셰이커에서 부드럽게 흔들어 항아리를 20 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 슬라이드를 꺼내 슬라이드 바닥을 닦습니다. 100 마이크로리터의 접합 항체 C3 fit C 및 IgG2 APE를 섹션에 첨가하고 가습된 챔버에서 1시간 동안 실온 인큐베이션한다. 셰이커에서 10분 동안 PBS 5%BSA 및 0.1%TW 20으로 섹션을 세 번 세척한 다음 슬라이드를 흔들어 건조시킵니다.
페이드 방지 시약으로 섹션을 장착 한 다음 커버 슬립으로 장착하십시오. 그런 다음 현미경으로 볼 때까지 슬라이드를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이미지 J 소프트웨어를 사용한 이미지 분석의 경우 원하는 영역의 윤곽을 그립니다.
그런 다음 분석을 클릭하여 표준 매개 변수를 설정 한 다음 측정 및 측정 영역을 설정하여 결과를 얻으십시오. 그런 다음 측정 창에서 가져온 데이터를 스프레드시트로 전송합니다. 완료되면 분석을 클릭하여 영역을 측정하고 데이터를 이전 스프레드 시트로 다시 전송합니다.
MRL LPR 마우스의 소변에서 단백질 수준은 대조군으로 인산염 완충 식염수와 치료군으로 락토바실러스 루테리로 처리한 시간 경과에 따라 검출되었습니다. L.reuteri로 치료한 마우스 그룹은 대조군보다 더 공격적인 단백뇨 진행을 보였습니다. 형질 세포를 분석하기 위해 분리된 신장 백혈구에 대해 팩스 분석을 수행하였다.
또한, 마우스를 대장균 이중 가닥 DNA와 함께 반코마이신 또는 반코마이신으로 처리하였다. 대장균 이중 가닥 DNA가 신장 침윤을 유발할 것으로 예상되었지만 형질 세포의 비율에는 큰 차이가 발견되지 않았습니다. 보체 C3 및 IgG2a를 여성 MRL IPR 신장 절편에서 면역형광 염색을 통해 검출하였다.
C3 및 IgG2a의 신장 침착에 대한 효과적인 환경 인자를 동물 시설에서 사내 마우스 빵과 공급 업체에서 구입 한 마우스에 대해 비교했습니다. 면역조직화학적 분석은 두 군 사이에 어떠한 차이도 나타내지 않았다. 백분율 스톡 ISO 20 Percoll 솔루션의 각 레이어를 추가하는 것은 어려울 수 있으며 혼합하면 다시 시작해야 합니다.
이 절차는 유세포 분석기 및 체외 실험에 도움이되므로 다른 신장 세포 유형의 집단을 연구 할 수 없습니다. 이 절차를 통해 우리는 신장에서 B 세포 침윤을 연구 할 수 있으며 문헌에는 많은 정보가 없습니다.
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