Biology
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Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung
Chapters
Summary July 14th, 2022
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Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.
Transcript
Die Maldi MS-Spektrometrie ist ein etabliertes und nützliches Werkzeug, um die Lipidhäufigkeit und -verteilung ohne übermäßige Probenmodifikation zu identifizieren und zu visualisieren. Der Hauptvorteil der Maldi-Bildgebung ist ihre Fähigkeit, die Lipide in situ ohne Markierung zu detektieren und eine große Anzahl von Proben gleichzeitig zu analysieren. Übung macht den Meister.
Stellen Sie sicher, dass Sie gut üben, bevor Sie die echten experimentellen Proben verarbeiten. Minimieren Sie die Probenvorbereitungszeit und vermeiden Sie Kontaminationen während des gesamten Verfahrens. Fügen Sie zunächst die optimale Schnitttemperatur oder OCT in ein Kunststoffkryo-Kryogerät bis zur Hälfte der Tiefe der Kryoform hinzu und vermeiden Sie dabei die Bildung von Blasen.
Lassen Sie die Form einige Minuten auf einer ebenen Oberfläche stehen und übertragen Sie sie dann auf Trockeneis. Halten Sie den Kryomold flach auf dem Trockeneis und lassen Sie das OCT eine ebene und ebene Oberfläche bilden. Warten Sie, bis das OCT vollständig in der Form verfestigt ist.
Verwenden Sie die gefrorenen OCT-Stufen sofort oder lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Betäubung der erwachsenen Fliegen Bereiten Sie mit Kohlendioxid eine Petrischale vor, die ein Stück Labortuch enthält. Verwenden Sie Wasser, um einen Teil des Tuchs zu befeuchten, um die statische Elektrizität zu reduzieren.
Halten Sie das Tuch halb nass und halb trocken. Nachdem Sie den Fliegenkopf unter einem Sezierfernrohr eins geschnitten haben, sammeln Sie vier bis fünf Köpfe und legen Sie sie auf den trockenen Bereich des Labortuchs. Nehmen Sie den OCT-Tisch vom Trockeneis zum zweiten Mikroskop.
Bringen Sie die Köpfe sofort in den OCT-Tisch und ordnen Sie sie schnell an, was etwa 30 bis 60 Sekunden dauert, um ein OCT-Schmelzen zu vermeiden. Lassen Sie etwa einen Millimeter leeren Raum um jedes Fliegenhirn, um eine ausreichende Unterstützung durch das OCT zu gewährleisten, und vier bis fünf Millimeter Leerraum vom Rand des Blocks, um ausreichend Platz für die Handhabung des Abschnitts zu schaffen. Stellen Sie die OCT-Stufe wieder auf das Trockeneis und lassen Sie sie etwa drei Minuten einwirken, um sicherzustellen, dass die OCT-Stufe gefroren und fest bleibt.
Nachdem alle Fliegenköpfe ausgerichtet sind, lassen Sie die OCT-Stufe weitere fünf bis 10 Minuten auf Trockeneis sitzen. Übertragen Sie die OCT-Stufe vom Trockeneis auf eine ebene Oberfläche und fügen Sie dann schnell eine große Menge OCT-Verbindung hinzu, um alle Proben abzudecken und die gesamte Kryoform zu füllen, was etwa drei Sekunden dauert. Übertragen Sie das Kryomold sofort zurück auf Trockeneis und frieren Sie den gesamten OCT-Block mit den eingebetteten Geweben ein.
Lassen Sie die OCT-Bühne weitere fünf bis 10 Minuten auf dem Trockeneis sitzen. Beschriften Sie die Proben am Rand des Kryomls und lagern Sie die gefrorenen Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Schneiden bereit sind. Bestätigen Sie die ITO-codierte Seite, indem Sie die Leitfähigkeit der ITO-Objektträger mit einem auf Widerstand eingestellten Voltmeter testen.
Markieren Sie die Seite mit einer Widerstandsmessung als die Seite, an der das Gewebe haften soll. Beschriften Sie es und legen Sie immer ein Labortuch auf den Boden des Objektträgers, um eine Kontamination des Objektträgers zu vermeiden. Lassen Sie dann das Gewebe 30 bis 45 Minuten in der Kryostatkammer ausgleichen.
Reinigen Sie den Kryostaten, vorzugsweise mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Rollplatte in der Stufe ab und entfernen Sie die verwendeten Klingen. Verwenden Sie zusätzliche saubere Tücher, um sicherzustellen, dass das Ethanol verdampft ist und dass alle Oberflächen trocken sind, bevor das Schneiden beginnt.
Als nächstes passen Sie die Temperatur des Kryostatkammer-Sandprobenkopfes an die Art des Gewebes an. Montieren Sie das Gewebe mit OCT auf dem Probenhalter. Achten Sie darauf, genügend OCT zu verwenden, um die Basis des OCT-Blocks abzudecken, und montieren Sie den Block so flach wie möglich.
Legen Sie eine saubere Klinge auf die Bühne und verriegeln Sie sie. Positionieren Sie den Kopf der Probe nach Bedarf auf dem Tisch, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden in dicken Abschnitten, bis der interessierende Bereich gefunden ist.
Bürsten Sie die zusätzlichen Teile ständig mit einem vorgekühlten Künstlerpinsel ab, um die Bühne sauber zu halten. Stellen Sie die Kammertemperatur nach Bedarf leicht ein und ändern Sie die Dicke der Abschnitte auf 10 bis 12 Mikrometer, sobald der gewünschte Bereich erreicht ist. Sammeln Sie sorgfältig den gewünschten Abschnitt.
Nehmen Sie einen ITO-Schieber bei Raumtemperatur und positionieren Sie ihn über dem Abschnitt. Nähern Sie sich dem Abschnitt vorsichtig und kleben Sie ihn auf den Objektträger, ohne Spuren auf der Kryostatstufe zu hinterlassen. Legen Sie den Objektträger in ein Gestell oder wischen Sie im Labor außerhalb des Kryostaten zwischen den Sammlungen mehrerer Abschnitte.
Wenn ein Vergleich zwischen verschiedenen Proben derselben Kohorte gewünscht wird, platzieren Sie die Abschnitte aus mehreren Proben auf einem einzigen Objektträger, damit sie gleichzeitig analysiert werden können, um die Streuung zu minimieren. Bei Bedarf auf zwei Dias trennen, da der Maldi-Zielhalter zwei Dias in einem Durchlauf aufnehmen kann. Transportieren Sie die Objektträger in einer Vakuumbox zu einer Austrocknung mit Austrocknung als unterster Schicht.
Fahren Sie die Objektträger 30 bis 60 Minuten lang unter Vakuum und fahren Sie dann mit der Matrixabscheidung fort. Verwenden Sie zwei Fünf-Dihydroxybenzoesäure oder DHB in Methanolwasser als Matrix. Legen Sie die Dias in einen Objektträgertransporter und verschließen Sie die Öffnung sicher mit der Wachsfolie.
Mit dem Reißverschlussbeutel verschließen. Legen Sie es in einen anderen Reißverschlussbeutel mit Trockenmittel. Beschriften Sie die Außenseite und senden Sie die Probe mit ausreichend trockenen Augen an die Maldi-Kernanlagen.
Verwenden Sie für die Matrixabscheidung 40 Milligramm pro Milliliter DHB und Methanolwasser als Matrix und sprühen Sie es mit einem automatischen HTX M5 Matrixsprühgerät. Verwenden Sie Stickstoffgasdruck von 10 PSI. Verwenden Sie eine Maldi-Flugzeit, ein MS-Instrument und einen positiven Ionenmodus, um ein Massenspektrum zu erfassen.
Kalibrieren Sie das Gerät, indem Sie 0,5 Mikroliter rote Phosphoremulsion in Aceto Nitro auf die ITO-Objektträger aufdecken. Verwenden Sie seine Spektren, um das Gerät im Massenbereich von 100 bis 1000 MZ zu kalibrieren, indem Sie eine quadratische Kalibrierkurve anwenden. Stellen Sie die Laserspotdurchmesser auf mittel ein, da es sich um das modulierte Strahlprofil für eine Rasterbreite von 40 Mikrometern handelt, und sammeln Sie Bilddaten, indem Sie 500 Aufnahmen mit einer Laserwiederholrate von 1000 Hertz pro Array-Position summieren.
Dann zeichnen Sie die Spektraldaten auf. Führen Sie die Bilddatenanalyse unter Verwendung der quadratischen Normalisierung durch, um Ionenbilder mit einer Bandbreite von plus minus 0,10 Dalton zu erzeugen. Richten Sie die Spektren des OCT und des Hirngewebes aus demselben Experiment mit der Software aus, um die überlappenden Peaks in der Ionenunterdrückungsinterferenz des OCT zu bewerten.
Schließlich verarbeiten Sie die MALDI-Objektträger mit den Gewebeproben durch Hämatoxylin und Eosin oder H- und E-Färbung. Bilder aus der Maldi-MS-Analyse zeigten eine allgemeine Abnahme des Lipidgehalts im LPR1-Knockout-mutierten Gehirn. Die repräsentativen H- und E-gefärbten adulten Fliegenhirnschnitte sind hier dargestellt.
Die Lipidspezies, ihre jeweiligen MZ-Werte und die Maßstäbe der Heatmap sind ebenfalls in diesem Bild dargestellt. Die durchschnittliche Falte der Reduktion der LPR1-Knockout-Mutante im Vergleich zu den Kontrollen von mindestens vier biologischen Replikaten wird als Zahlen neben den Pfeilen angezeigt. Das Massenspektrum der ausgewählten leeren OCT-Region in der Hirngeweberegion sowohl von der Kontroll- als auch von der mutierten Fliege wird im Bereich von MZ1 bis 1000 und MZ520 bis 900 gezeigt.
Die Interferenz der OCT ist sowohl mit Ionenunterdrückungsphänomenen als auch mit überlappenden Signalproblemen verbunden. Um die Genauigkeit der Lipidomik-Daten zu erhalten, sind eine geeignete Probenvorbereitung, Dissektion und Kryosektion von entscheidender Bedeutung. Nach Durchführung des Maldi-Experiments können die Identitäten der Lipide durch LCMS, auch bekannt als Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie-basierte Lipodomics, überprüft werden.
Diese Technik gewinnt molekulare Einblicke in die Homöostase von Gehirnlipiden, indem sie das leistungsstarke bis weiche Modellsystem verwendet, das den Weg zum Verständnis menschlicher krankheitsbedingter metabolischer Veränderungen im Gehirn ebnet.
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