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Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)
Chapters
Summary May 24th, 2022
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Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.
Transcript
A transfecção das células HEK293T deve ser realizada com 90% de confluência. Além disso, o uso de um filtro de ligação de baixa proteína de 0,45 mícrons para filtragem de vetores lentiviral e o uso de uma almofada de sacarose para ultracentrifugação são essenciais. Comece por cultivar células HEK293T em meio DMEM contendo estreptomicina de penilina de 10% e 1X a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio até que as células atinjam 90% de confluência antes de semear para transfeção.
Semente quatro vezes 10 a seis células em 10 mililitros de meio de crescimento completo em uma placa de cultura tecidual de 100 milímetros e crescer durante a noite em uma incubadora de cultura tecidificada com uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Para cada transfecção, dilui um miligrama por mililitro de estoques de DNA plasmídeo em um mililitro de mídia DMEM livre de soro em tubos de centrífugas de 1,5 mililitro, seguindo a razão de plasmídeos de entrada e embalagem, conforme descrito no manuscrito do texto. Vórtice do tubo por 10 segundos e gire a 10.000 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente para coletar.
Em seguida, adicione 70 microlitres de um miligrama por mililitro de solução de estoque de polietileneimina, ou PEI, ao tubo. Novamente, vórtice e gire brevemente o tubo. Para transeção à base de lipofectamina, diluir os vetores em 500 microliters de mídia DMEM sem soro contendo 45 microliters de reagente P fornecidos no kit.
Em seguida, diluir 70 microliters de reagente L usando 500 microliters do mesmo meio. Incubar os dois tubos à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para permitir uma formação complexa.
Em seguida, adicione um mililitro de DNA PEI ou complexos de lipofectamina de DNA à placa contendo células e incubar por seis horas a 37 graus Celsius com uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio. Após a incubação, substitua a mídia por 10 mililitros de mídia de crescimento completo fresco e devolva a placa à incubadora. Após dois dias de transfecção, colete a mídia contendo vírus e sobreponha as células com 10 mililitros de mídia de crescimento completa fresca.
Novamente, após três dias de transfecção, colete os meios de comunicação contendo vírus e combine-os com as mídias coletadas no ponto de tempo de dois dias. Centrifugar o supernaente viral a 2.000 vezes G por 10 minutos a 4 graus Celsius para pelotar detritos celulares. Filtre o supernascer usando um filtro de ligação de proteína de baixo tamanho de 0,45 mícron e armazene a quatro graus Celsius até estar pronto para a ultracentrifugação.
Esterilize os tubos de ultracentrifuge' segurando copos lavando com 70% de etanol por 10 minutos. Ar seco, feche e coloque as xícaras a quatro graus Celsius. Adicione 36 mililitros em mídia filtrada contendo partículas lentivirais a um tubo ultracentrífuga estéril.
Encha cinco mililitros de uma stripette estéril com quatro mililitros de solução estéril de 20% de sacarose preparada em PBS e dispense-a para o fundo do tubo contendo vetores lentivirais, ou LVS. Certifique-se de que a solução de sacarose não deve ser misturada com a mídia e faça um gradiente na parte inferior do tubo. Equilibre todos os tubos de ultracentrifuuge usando mídia DMEM sem soro, coloque os tubos em tubos de ultracentrifusagem frio segurando copos e feche as tampas.
Gire os tubos a 125.000 vezes G por duas horas a quatro graus Celsius. Após o giro, descarte cuidadosamente o supernasce, invertendo o conteúdo do tubo em um recipiente contendo alvejante sem perturbar a pelota. Marque a pelota se for visível.
Coloque o tubo ultracentrífuga em um tubo estéril de 50 mililitros e adicione 200 microliters de DPBS estéreis na parte superior da pelota. Coloque o tubo a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, misture suavemente o conteúdo de um tubo por tubos para cima e para baixo antes de girar a 13.000 vezes G em uma centrífuga de mesa para pelotar quaisquer detritos.
Transfira o supernatante para um novo tubo e aliquot a preparação do vírus. Finalmente, armazene os tubos a menos 80 graus Celsius. Após a transfecção, a expressão GFP abundante foi observada em células HEK293T.
A expressão das proteínas virais resultou na formação de sincronia de células HEK293T onde células únicas são fundidas. Após a infecção, a expressão marcada de GFP também foi observada em células progenitoras neurais infectadas pelo viral. A medição do título de LVS entre o PEI de baixo custo e o reagente lipofectamina 3000 não mostrou diferença significativa no título viral.
Os títulos virais para vetores baseados em PLK 0.1 são mostrados aqui. As células transfectadas lentiviral mostraram mais de 80% de viabilidade celular em comparação com células não transduzidas, enquanto nenhuma célula sobreviveu ao tratamento. A análise da mancha ocidental mostrou expressão abundante de L-2-hidroxiglutarate desidrogenase em células transduzidas com uma espinha dorsal vetorial vazia.
No entanto, nenhuma expressão foi observada em células transduzidas com um vetor portador de RNAs de pinos de cabelo curtos. A principal vantagem desta técnica é o uso de polietileneimina de polímero cationic de baixo custo para produzir partículas lentivirais através da co-transfecção de células HEK293T usando vetores de entrada e embalagem.
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