Cancer Research
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फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान और संवर्धन के लिए फार-रेड फ्लोरोसेंट सेनेसेंस-संबद्ध β-गैलेक्टोसिडेस जांच
Chapters
Summary September 13th, 2022
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सेल कल्चर या मुराइन ट्यूमर मॉडल में कीमोथेरेपी दवाओं द्वारा प्रेरित सेनेसेंट कैंसर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट, फ्लो साइटोमेट्रिक परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। वैकल्पिक प्रक्रियाओं में सह-इम्यूनोस्टेनिंग, बड़े बैच या समय बिंदु विश्लेषण की सुविधा के लिए नमूना निर्धारण, और प्रवाह साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग द्वारा व्यवहार्य सेनेसेंट कोशिकाओं का संवर्धन शामिल है।
Transcript
हमारा मल्टी-पैरामीटर फ्लो साइटोमेट्री प्रोटोकॉल ट्यूमर कोशिकाओं में चिकित्सा-प्रेरित सेनेसेंस का तेजी से और बेहतर पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो कैंसर जीव विज्ञान और चिकित्सा में चल रहे अध्ययन की एक शर्त है। हमारे फ्लो साइटोमेट्री सेनेसेंस परख मौजूदा माइक्रोस्कोपी-आधारित परख की तुलना में अधिक तेज है। हम केवल एक के बजाय दो मार्करों का उपयोग करते हैं, सेनेसेंट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, परख विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए।
रुचि के अतिरिक्त लक्ष्यों का पता लगाने के लिए कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ सह-दाग दिया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टिंग का उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए सेनेसेंट कोशिकाओं की आबादी को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। परख सुसंस्कृत कैंसर सेल लाइनों में, या कोमल पृथक्करण के बाद पूरे ट्यूमर के नमूनों में सेनेसेंट कोशिकाओं का पता लगा सकती है।
इस तकनीक का प्रयास करने से पहले, उपयोग किए जा रहे प्रवाह साइटोमीटर की सामान्य संचालन प्रक्रियाओं से परिचित होना महत्वपूर्ण है। अनुशंसित प्रवाह साइटोमीटर विनिर्देशों के लिए कृपया पाठ से परामर्श करें। दवाओं द्वारा सेनेसेंस प्रेरण से एक दिन पहले, 0.25% ट्रिप्सिन ईडीटीए के साथ कैंसर सेल लाइन कल्चर की कटाई करें।
ट्रिप्सिन को सक्रिय करने के लिए कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और सेल मोनोलेयर को अलग करें। जब मोनोलेयर स्पष्ट रूप से अलग हो जाता है, तो पूर्ण संस्कृति माध्यम की समान मात्रा जोड़कर ट्रिप्सिन को बेअसर करें। सेल निलंबन को बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
मानक हेमोसाइटोमीटर विधि का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं को रिकॉर्ड करें। एक मानक छह-वेल प्लास्टिक कल्चर प्लेट में प्रति वर्ग सेंटीमीटर एक बार 10 से तीसरे से 10 गुना 10 से तीसरे सेल पर प्लेट सेल। 5% कार्बन डाइऑक्साइड और आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, कोशिकाओं को रुचि के सेनेसेंस-उत्प्रेरण एजेंट के साथ इलाज करें, जैसे कि एटोपोसाइड। फिर सेनेसेंस की शुरुआत की अनुमति देने के लिए चार दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। अपेक्षित आकृति विज्ञान परिवर्तनों के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदिन कोशिकाओं की जांच करें।
सेनेसेंस की शुरुआत के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ट्रिप्सिन ईडीटीए जोड़कर कोशिकाओं को काट लें। जब कोशिकाओं को निलंबन में अलग कर दिया जाता है, तो ट्रिप्सिन को पूर्ण माध्यम की समान मात्रा के साथ बेअसर करें। सेल निलंबन के प्रत्येक कुएं को 1.7-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
कोशिकाओं को फिर से गिनें और ट्यूबों के एक नए सेट में प्रति नमूने समान संख्या में कोशिकाओं को एलिकोट करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 1,000 ग्राम पर पांच मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। सबसे पहले, डीएमईएम में एक माइक्रोमोलर बेफिलोमाइसिन ए के समाधान को सेल पेलेट में प्रति मिलीलीटर छठी कोशिकाओं में एक गुना 10 की एकाग्रता पर जोड़कर सुसंस्कृत सेल नमूनों के लाइसोसोमल पीएच को समायोजित करें, और मिश्रण करने के लिए पिपेट।
धीमी गति से घूमने वाले पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस के लिए दाग लगाने के लिए, धोए बिना नमूने में 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पर डीडीएओजी स्टॉक समाधान जोड़ें। प्रत्यक्ष प्रकाश से सुरक्षित 60 मिनट के लिए एक घूर्णन पर रखें।
पहले की तरह, ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और पीबीएस में बर्फ के ठंडे 0.5% बीएसए के एक मिलीलीटर के साथ गोली धोएं। फिर धुले हुए सेल छर्रों में पतला कैल्सीन वायलेट 450 एएम समाधान के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
सेल नमूनों को प्रवाह साइटोमेट्री उपकरण-संगत ट्यूबों में स्थानांतरित करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, एक बैंगनी चैनल हिस्टोग्राम और एक दूर-लाल चैनल बनाम ग्रीन चैनल डॉट प्लॉट खोलें। कम सेवन गति पर साइटोमीटर डेटा अधिग्रहण शुरू करें और सेवन पोर्ट पर डीडीएओजी के साथ दाग वाले सकारात्मक नियंत्रण नमूने रखें।
नमूना डेटा प्राप्त करना शुरू करें। चैनल वोल्टेज को इस तरह समायोजित करें कि प्रत्येक प्लॉट के भीतर 90% से अधिक घटनाएं निहित हों। जब सभी सेटिंग्स इष्टतम होती हैं, तो प्रति नमूना 10, 000 ईवेंट रिकॉर्ड करें।
इंटेक पोर्ट पर डीडीएओजी से सना वाहन-केवल नियंत्रण नमूने रखें। डेटा अधिग्रहण शुरू करें और प्रति नमूना 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें। ऑटोफ्लोरेसेंस, या एएफ, और डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड सिग्नल बनाम सकारात्मक नियंत्रण में वृद्धि की तलाश करें।
नमूना डेटा को fcs फ़ाइल स्वरूप में सहेजें, और फ़ाइलों को प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर से लैस वर्कस्टेशन कंप्यूटर पर निर्यात करें। साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, अधिग्रहित सभी नमूनों के लिए एफसीएस डेटा फ़ाइलों को लोड करें। सबसे पहले, व्यवहार्य कोशिकाओं को गेट करने के लिए, वाहन-केवल नियंत्रण के लिए नमूना डेटा पर डबल-क्लिक करें ताकि इसकी डेटा विंडो खुल सके।
डेटा को वायलेट चैनल हिस्टोग्राम के रूप में विज़ुअलाइज़ करें। सीवी 450 द्वारा दागी व्यवहार्य कोशिकाएं, मृत कोशिकाओं की तुलना में उनके उज्जवल प्रतिदीप्ति पर आधारित होती हैं। केवल व्यवहार्य कोशिकाओं को शामिल करने के लिए सिंगल गेट हिस्टोग्राम टूल का उपयोग करके एक गेट खींचें।
गेट को व्यवहार्य नाम दें। फिर गेट को समान रूप से लागू करने के लिए नमूना लेआउट विंडो से अन्य सेल नमूनों पर व्यवहार्य गेट खींचें। लेआउट विंडो खोलें।
लेआउट विंडो में, सभी नमूनों को बैंगनी चैनल हिस्टोग्राम के रूप में विज़ुअलाइज़ करें। सत्यापित करें कि व्यवहार्य सेल गेटिंग नमूनों में उपयुक्त है। यदि नहीं, तो आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
इसके बाद, सेनेसेंट कोशिकाओं को गेट करने के लिए, वाहन-केवल नियंत्रण के लिए गेटेड व्यवहार्य सेल डेटा पर डबल-क्लिक करें ताकि इसकी डेटा विंडो खुल सके। फिर डेटा को दूर-लाल चैनल बनाम हरे चैनल के लिए डॉट प्लॉट के रूप में कल्पना करें। ऊपरी दाएं चतुर्थांश से 5% से कम डीडीएओ-पॉजिटिव और एएफ-पॉजिटिव कोशिकाओं को शामिल करने के लिए आयताकार गेटिंग टूल का उपयोग करके एक गेट खींचें।
द्वार का नाम सेनेसेंट रखें। फिर गेट को समान रूप से लागू करने के लिए नमूना लेआउट विंडो से सभी नमूनों के व्यवहार्य उप-समूह पर सेनेसेंट गेट खींचें। लेआउट विंडो में, सभी व्यवहार्य सेल-गेटेड उपसमुच्चय खींचें और छोड़ें।
सभी व्यवहार्य नमूनों को दूर-लाल बनाम हरे चैनल डॉट प्लॉट के रूप में कल्पना करें, और परिणामों का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि सभी भूखंडों पर सेनेसेंट गेट दिखाई दे रहा है और वाहन-केवल नियंत्रण के लिए गेट 5% से कम सेनेसेंट कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है। विश्लेषण अब पूरा हो गया है।
डेटा अब ग्राफिकल और टेबल प्रारूप में वांछित रूप से निर्यात किया जा सकता है। अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में, एटोपोसाइड द्वारा प्रेरित सेनेसेंट बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं ने बढ़े हुए आकारिकी और नीले धब्बे का प्रदर्शन किया, जो ऊंचा सेनेसेंस से जुड़े बीटा-गैलेक्टोसिडेस द्वारा एक्स-गैल की दरार के कारण था। फ्लोरोसेंट सी 12 एफडीजी, या डीडीएओजी के साथ एटोपोसाइड-उपचारित कोशिकाओं के धुंधलापन ने एक्स-गैल के लिए तुलनीय धुंधला पैटर्न और तीव्रता भिन्नताओं का प्रदर्शन किया।
हालांकि, हरे रंग के C12FDG उत्सर्जन के साथ सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस ओवरलैपिंग को बिना दाग वाली सेनेसेंट कोशिकाओं में जमा होने के लिए दिखाया गया था। इसके विपरीत, डीडीएओजी के दूर-लाल उत्सर्जन रेंज में ऑटोफ्लोरेसेंस आमतौर पर नगण्य था। स्कैटर प्लॉट्स के लिए फ्लो साइटोमीटर डेटा अधिग्रहण सेटअप, पांच-पीक वाणिज्यिक इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट कैलिब्रेशन माइक्रोसेफर्स, और दाग वाली कोशिकाओं से एकल-चैनल फ्लोरेसेंस डेटा यहां दिखाए गए हैं।
बी 16-एफ 10 मेलेनोमा कोशिकाओं के लिए डीडीएओजी प्रवाह साइटोमीटर सेनेसेंस परख डेटा से पता चला है कि एटोपोसाइड द्वारा प्रेरित थेरेपी-प्रेरित सेनेसेंस, या टीआईएस, 35% व्यवहार्य कोशिकाओं में हुआ, और सेनोलिटिक एजेंट एबीटी -263 ने टीआईएस कोशिकाओं को लगभग समाप्त कर दिया। ए 549 फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं में, व्यवहार्य कोशिकाओं के 66% में ब्लीमाइसिन-प्रेरित टीआईएस और एबीटी -263 ने प्रतिशत को 15 तक कम कर दिया। अकेले एबीटी -263 अनुपचारित प्रसार कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं था।
एक एंटीबॉडी सह-धुंधला परख में, पीई चैनल डेटा के एक हिस्टोग्राम से पता चला है कि 42% एटोपोसाइड-उपचारित कोशिकाएं सेनेसेंस मार्कर डीपीपीपी 4-पॉजिटिव के लिए सकारात्मक थीं। इसके अलावा, दो-आयामी डॉट प्लॉट के साथ विज़ुअलाइज़ेशन ने संकेत दिया कि 44% एटोपोसाइड-उपचारित कोशिकाएं डीडीएओजी और डीपीपी 4 के लिए डबल पॉजिटिव थीं, जबकि वाहन-केवल कोशिकाओं का 4%। डीडीएओजी दाग वाली कोशिकाओं के निर्धारण का अगला मूल्यांकन किया गया था।
अनिर्धारित नियंत्रण नमूनों की तुलना में, निश्चित नमूनों ने अनुपचारित कोशिकाओं में थोड़ी अधिक पृष्ठभूमि का प्रदर्शन किया, जिसमें बीएलएम-उपचारित कोशिकाओं में सेनेसेंट के रूप में स्कोर करने वाली कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत था। यह प्रभाव रात भर संग्रहीत निश्चित नमूनों में भी देखा गया था, और एक सप्ताह के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। आकृति विज्ञान और प्रसार मार्करों द्वारा समृद्ध सेनेसेंट सेल आबादी के फ्लो साइटोमेट्री सॉर्टिंग और सत्यापन दिखाए गए हैं।
क्रमबद्ध सेनेसेंट कोशिकाओं ने बढ़े हुए आकृति विज्ञान को प्रदर्शित किया, जैसा कि अपेक्षित था, फ्लोरोसेंट फेलोइडिन के साथ एक्टिन को धुंधला करके कल्पना की गई थी। इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग द्वारा प्रसार मार्कर Ki67 के लिए संकेत में कमी भी देखी गई थी। अंत में, कीमोथेरेपी दवाओं के साथ इलाज किए गए ट्यूमर में सेनेसेंस की मात्रा का आकलन किया गया था।
ऊतकों में एक्स-गैल धुंधलापन अपेक्षाकृत कमजोर था, लेकिन डॉक्सोर्यूबिसिन, या पेगिलेटेड लिपोसोमल डॉक्सोर्यूबिसिन के साथ इलाज किए गए ट्यूमर में नीला धुंधलापन स्पष्ट था, विशेष रूप से ट्यूमर में जो डीडीएओ-गैलेक्टोसाइड प्रवाह परख द्वारा सेनेसेंस के लिए सकारात्मक स्कोर करते थे। जैसा कि अपेक्षित था, खारा-केवल ट्यूमर ने नगण्य शिथिलता का प्रदर्शन किया। यहां, किसी भी लाइव सेल परख के साथ, प्रोटोकॉल चरणों को कुशलतापूर्वक किया जाना चाहिए, लेकिन धीरे से।
लंबे समय तक धुंधला प्रक्रियाओं, या उल्लिखित समय से परे ऊष्मायन से बचा जाना चाहिए। यदि सेनेसेंट कोशिकाओं को साइटोमेट्रिक रूप से क्रमबद्ध किया जाता है, तो उन्हें इम्यूनोएसे, या लाइसेड के लिए संस्कृति में वापस रखा जा सकता है, और ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स, या प्रोटिओमिक्स सहित ओमिक्स विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है। इस तकनीक ने हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों को डीएनए क्षति, प्रोटीन अभिव्यक्ति और चयापचय में परिवर्तन सहित सेनेसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की नई विशेषताओं की पहचान करने में सक्षम बनाया है।
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