Cancer Research
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远红荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针，用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞
Chapters
Summary September 13th, 2022
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提出了一种荧光流式细胞术定量由细胞培养或小鼠肿瘤模型中化疗药物诱导的衰老癌细胞的方案。可选程序包括共免疫染色、便于大批量或时间点分析的样品固定，以及通过流式细胞术分选富集活衰老细胞。
Transcript
我们的多参数流式细胞术方案能够快速和改进地检测肿瘤细胞中治疗诱导的衰老，这是癌症生物学和治疗中正在进行的研究条件。我们的流式细胞术衰老检测比现有的基于显微镜的检测更快。我们使用两个标记物，而不仅仅是一个，来识别衰老细胞，提高测定可靠性。
细胞可以与荧光抗体共染色，以检测其他感兴趣的靶标。流式细胞术分选可用于富集衰老细胞群以进行下游分析。该测定可以检测培养的癌细胞系中的衰老细胞，或在温和解离后的整个肿瘤样品中。
在尝试这种技术之前，熟悉所使用的流式细胞仪的一般操作程序非常重要。有关推荐的流式细胞仪规格，请参阅文本。在药物诱导衰老前一天，用0.25%胰蛋白酶EDTA收获癌细胞系培养物。
将细胞置于37摄氏度下五分钟以激活胰蛋白酶，并分离细胞单层。当单层明显脱落时，通过加入等体积的完全培养基来中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移到无菌锥形管中。
使用标准血细胞计数器方法计数细胞，并记录每毫升细胞数。在标准的六孔塑料培养板中以每平方厘米10至3至10倍10至第三细胞的速度板细胞。将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和湿度下孵育过夜。
第二天，用感兴趣的衰老诱导剂（如依托泊苷）处理细胞。然后孵育四天以允许衰老开始。每天在光学显微镜下检查细胞，以了解预期的形态变化。
衰老开始后，通过在37摄氏度下添加胰蛋白酶EDTA五分钟来收获细胞。当细胞解离成悬浮液时，用等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。将每个细胞悬液孔转移到1.7毫升微量离心管中。
再次计数细胞并将每个样品等分到一组新的试管中。将试管在4摄氏度下以1， 000g离心5分钟，然后除去上清液。首先，通过将DMEM中一微摩尔巴非霉素A的溶液以每毫升1乘以10至第六个细胞的浓度添加到细胞沉淀中，并移液混合来调节培养细胞样品的溶酶体pH值。
在 37 摄氏度的旋转器上以慢速孵育 30 分钟。然后为了染色衰老相关的β-半乳糖苷酶，在不洗涤的情况下以每毫升10微克的速度向样品中加入DDAOG储备溶液。放在旋转器上 60 分钟，避免光线直射。
像以前一样，离心管，除去上清液，并在PBS中用一毫升冰冷的0.5%BSA洗涤沉淀。然后将300微升稀释的钙黄绿素紫450AM溶液加入洗涤的细胞沉淀中。在黑暗中在冰上孵育15分钟。
将细胞样品转移到流式细胞仪兼容的试管中。在数据采集软件中，打开紫色通道直方图和远红色通道与绿色通道点图。以低进样速度启动细胞仪数据采集，并将用DDAOG染色的阳性对照样品放在进样口。
开始获取样本数据。调整通道电压，使每个图中包含90%以上的事件。当所有设置都最佳时，每个样本记录 10， 000 个事件。
将沾有DDAOG的车辆专用对照样品放在进气口上。启动数据采集并为每个样本记录 10， 000 个事件。寻找自发荧光或 AF 和 DDAO-半乳糖苷信号与阳性对照的升高。
将样品数据保存为fcs文件格式，并将文件导出到配备流式细胞术分析软件的工作站计算机。使用细胞术数据分析软件，加载所有采集样品的 fcs 数据文件。首先，要对活细胞进行门控，请双击仅车辆控件的示例数据以打开其数据窗口。
将数据可视化为紫色通道直方图。用CV 450染色的活细胞基于其比死细胞更亮的荧光。使用单门直方图工具绘制门以仅包含活细胞。
将门命名为可行。然后将“可行门”从示例布局窗口拖到其他单元格样本上，以均匀应用门。打开布局窗口。
在布局窗口中，将所有样本可视化为紫色通道直方图。验证活细胞门控是否适合所有样品。如果没有，请根据需要进行调整。
接下来，要对衰老细胞进行门控，请双击仅车辆控件的门控活细胞数据以打开其数据窗口。然后将数据可视化为远红色通道与绿色通道的点图。使用矩形门控工具绘制门，以包含右上象限中少于 5% 的 DDAO 阳性和 AF 阳性细胞。
将大门命名为Senescent。然后从示例布局窗口中将 Senescent 门拖动到所有样本的可行子集上，以均匀应用门。在布局窗口中，拖放所有可行的单元门控子集。
将所有可行样本可视化为远红色与绿色通道点图，并观察结果。确保衰老门在所有图上都可见，并且仅车辆控制的门显示小于5%的衰老细胞。分析现已完成。
现在可以根据需要以图形和表格格式导出数据。与未处理的细胞相比，依托泊苷诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞由于衰老相关β-半乳糖苷酶升高切割X-gal而表现出扩大的形态和蓝色染色。用荧光C12FDG或DDAOG对依托泊苷处理的细胞进行染色显示出与X-gal相当的染色模式和强度变化。
然而，与绿色C12FDG发射重叠的细胞自发荧光在未染色的衰老细胞中积聚。相比之下，自发荧光在DDAOG的远红光发射范围内通常可以忽略不计。此处显示了散点图的流式细胞仪数据采集设置、五峰商用彩虹荧光校准微球以及染色细胞的单通道荧光数据。
DDAOG流式细胞仪B16-F10黑色素瘤细胞衰老测定数据显示，依托泊苷诱导的35%活细胞发生治疗诱导的衰老（TIS），增肽剂ABT-263几乎消除了TIS细胞。在A549肺癌细胞中，博来霉素诱导的TIS在66%的活细胞和ABT-263中将百分比降低到15。单独的ABT-263对未经处理的增殖细胞没有毒性。
在抗体共染色测定中，PE 通道数据的直方图显示，42% 的依托泊苷处理的细胞对衰老标志物 DPPP4 阳性呈阳性。此外，二维点图的可视化表明，44%的依托泊苷处理的细胞对DDAOG和DPP4呈双阳性，而仅载体细胞为4%。接下来评估DDAOG染色细胞的固定。
与未固定的对照样品相比，固定样品在未处理的细胞中表现出略高的背景，在BLM处理的细胞中评分为衰老的细胞百分比较高。在过夜储存的固定样品中也观察到了这种效应，并在四摄氏度下储存一周。显示了流式细胞术分选和通过形态和增殖标志物对富集衰老细胞群的验证。
分选的衰老细胞显示出扩大的形态，正如预期的那样，通过用荧光鬼笔环肽染色肌动蛋白来可视化。通过免疫荧光染色也观察到增殖标志物Ki67信号的降低。最后，评估了用化疗药物治疗的肿瘤衰老的定量。
组织中的 X-gal 染色相对较弱，但在用阿霉素或聚乙二醇化脂质体阿霉素治疗的肿瘤中，蓝色染色很明显，特别是在通过 DDAO-半乳糖苷流动测定也获得衰老阳性的肿瘤中。正如预期的那样，仅盐水肿瘤表现出可以忽略不计的衰老。在这里，与任何活细胞测定一样，方案步骤应有效但温和地执行。
应避免长时间的染色程序或超过上述时间的孵育。如果对衰老细胞进行流式细胞术分选，则可以将它们放回培养物中进行免疫测定，或裂解并进行处理以进行组学分析，包括转录组学或蛋白质组学。这项技术使我们的实验室和其他人能够识别衰老肿瘤细胞的新特征，包括DNA损伤，蛋白质表达和代谢变化的定量。
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