Cancer Research
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Medição da Compressão de Células e Núcleos Baseados em Microdevice Acoustofluidic
Chapters
Summary July 14th, 2022
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Aqui é apresentado um protocolo para construir um sistema rápido e não destrutivo para medir a compressão celular ou núcleo com base em microdispositivos acoustofluidos. Foram investigadas alterações nas propriedades mecânicas das células tumorais após transição epitelial-mesenquimal ou radiação ionizante, demonstrando a perspectiva de aplicação desse método em pesquisa científica e prática clínica.
Transcript
A mecânica celular desempenha um papel importante na metástase tumoral, transformação maligna das células e radiosensibilidade. O método acoustofluido pode realizar uma medição rápida e não destrutiva em estados suspensos. Esta técnica pode ser usada para espelhar a mudança da autocompribilidade durante a transição epitelial para a transição mesenquimal e separar as células tumorais circulantes, mostrando suas perspectivas de aplicação no diagnóstico de câncer.
Para começar, ligue o bloco PDMS ao chip perfurando furos no bloco PDMS para portas de entrada e saída com uma agulha oca de um milímetro de diâmetro. Em seguida, coloque os blocos PDMS e chip com o traseiro para cima em um limpador de plasma por um minuto. Depois de alinhar os orifícios nos blocos PDMS com a entrada e saída do chip, pressione suavemente os blocos PDMS para o chip por 15 segundos, resultando em ligação entre os blocos PDMS e a superfície do chip.
Para conectar o cateter PTFE ao chip, corte dois pedaços de cateter com diâmetro interno de 0,8 milímetros e um comprimento de 10 centímetros. Dobre uma agulha de aço inoxidável com um diâmetro interno de 0,7 milímetros e um comprimento de 1,5 centímetro por 90 graus em uma forma L e conecte-a a uma extremidade do cateter. Insira as agulhas de aço inoxidável nos orifícios dos blocos PDMS.
Para a entrada, conecte uma agulha de distribuição de calibre 19 à outra extremidade do cateter como conector para uma seringa. Depois, injete água deionizada para testar o aperto do canal geral. Para um conjunto cerâmico piezoelétrico, selecione folhas de cerâmica piezoelétricas pré-cortadas com uma largura de cinco milímetros.
Em seguida, soldar fios em ambos os lados da cerâmica piezoelétrica em uma extremidade. Cole a cerâmica piezoelétrica no meio da parte de trás do chip colocando uma gota de cola de cianoacrilato na cerâmica piezoelétrica. Suavize a cola com o palito e remova o excesso de cola.
Em seguida, pressione-o rapidamente no chip e continue pressionando por cerca de um minuto. Para montar o micro dispositivo, corte um pedaço de PDMS como base do micro dispositivo e coloque um lado da base nos blocos PDMS de entrada e saída e do outro lado em um slide de vidro transparente usando fita dupla face. Fixar todo o microdispositivo no estágio do microscópio para manter o chip em um plano focal.
Para preparar as soluções de partículas padrão de poliestireno adicione 0,05 mililitros de solução de partículas de poliestireno a 10 mililitros de PBS e misture bem. Em seguida, prepare as suspensões celulares lavando as células aderentes a 90% de confluência com PBS. Adicione 500 microliters de 0,25 Trypsin por um a dois minutos em temperatura ambiente.
Depois de remover o Trypsin, adicione um mililitro completo e forme uma suspensão celular por pipetação. Em seguida, centrifugar a suspensão da célula a 100 G por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspend em 0,5 a um mililitro de PBS para obter uma suspensão celular.
Em seguida, as células foram contadas com um hemócito e a concentração foi de cerca de 300 a 500.000 células por mililitro. Após um preparo da suspensão do núcleo celular como demonstrado anteriormente, remova o supernante e adicione 200 microliters de reagente de extração de proteína citoplasmática A por 20 microliters paleta celular e misture bem. Em seguida, o vórtice da mistura acima a 220 G por cinco segundos e coloque no banho de gelo por 10 minutos.
Em seguida, adicione 10 microliters de reagente de extração de proteína citoplasmática B à solução após a incubação. Após o vórtice, coloque no banho de gelo por um minuto e vórtice novamente a 220 G por cinco segundos. Então, finalmente centrífuga a 1000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Remova o supernatante e resuspenda a paleta em um mililitro de PBS. Em seguida, centrífuga a 1000 G a quatro graus Celsius por quatro minutos. Depois de remover o supernascer, resuspende em 100 microlitres de PBS como suspensão do núcleo celular.
Adicione o azul trypan à suspensão do núcleo celular acima e colorir à temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, conte o número de núcleos sob o microscópio invertido com um objetivo de 10x. Diluir a suspensão do núcleo celular acima com tampão PBS para uma concentração de 200 a 300.000 núcleos por mililitro.
Em seguida, filtrar a suspensão do núcleo celular através de uma peneira de 70 micrômetros. Para configurar o sistema de medição, ligue a fonte de luz do microscópio e abra o software da câmera. Use o objetivo 4x para encontrar a posição média do microcanal, ou seja, a posição da cerâmica piezoelétrica.
Após a conexão dos fios, solde-os aos terminais positivos e negativos da saída do gerador de sinal da cerâmica piezoelétrica, respectivamente. Em seguida, coloque a seringa na bomba de microinjeção e conecte-a ao cateter de entrada. Para recolher o fluido do microcanal, coloque um pequeno recipiente no final do cateter de saída.
Para determinar os parâmetros de medição, aspire a solução de partículas de poliestireno com a seringa. Em seguida, injete a solução no microcanal do chip, evitando bolhas de ar e no microcanal do chip para garantir uma medição precisa. Defina a saída do gerador de sinal para um sinal de sinalização com uma frequência de um mega-hertz e tensão de pico para pico de 10 volts até que seja observado que as partículas se movem em direção à linha média do microcanal e permanecem em movimento dianteiro ao longo da linha média depois de atingir a linha média.
Depois de misturar uma célula mililitro ou suspensão de núcleo com a solução de partículas padrão na proporção de um para um, injete-o no microcanal com uma seringa para medir células e núcleos. Comece a gravar com a câmera CCD quando as células ou núcleos entrarem no campo de visão e ligam o gerador de sinal. Em seguida, enxágue o microcanal com água deionizada, 75% de álcool e água deionizada em sequência para uso posterior.
O movimento das células e partículas foi observado sob a ação da força do campo acústico em direção à linha média do microcanal em diferentes intervalos de tempo. Foram realizados o cálculo de energia, densidade e compressão celular e densidade de energia acústica e a trajetória de movimento medido para a partícula foi obtida a partir do melhor resultado de montagem. A alta pureza e os núcleos intactos foram isolados das células e a medição de compressão do núcleo foi alcançada através da obtenção da trajetória de movimento do núcleo.
A compressão de diferentes tipos de células cancerígenas após a irradiação de paramédicos ou raios-x induzidas por drogas com diferentes doses foi medida e comparada. As células medidas foram coletadas e verificou-se que não houve diferença significativa na proliferação celular e viabilidade em relação ao grupo não tratado após 48 horas de cultura. Indicando que a medição da compressão não tem efeito na proliferação e sobrevivência celular.
O mais importante é ajustar a frequência do sinal até que se observe que as partículas se movem em direção à linha média do microcanal.
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