Cancer Research
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Medición de la compresibilidad de célula y núcleo basada en microdispositivo acustofluídico
Chapters
Summary July 14th, 2022
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Aquí se presenta un protocolo para construir un sistema rápido y no destructivo para medir la compresibilidad de células o núcleos basado en microdispositivos acustofluídicos. Se investigaron los cambios en las propiedades mecánicas de las células tumorales después de la transición epitelial-mesenquimal o la radiación ionizante, lo que demuestra la perspectiva de aplicación de este método en la investigación científica y la práctica clínica.
Transcript
La mecánica celular juega un papel importante en la metástasis tumoral, la transformación maligna de las células y la radiosensibilidad. El método acustofluídico puede realizar mediciones rápidas y no destructivas en estados suspendidos. Esta técnica se puede utilizar para reflejar el cambio de autocompresibilidad durante la transición epitelial a mesenquimal y separar las células tumorales circulantes, mostrando sus perspectivas de aplicación en el diagnóstico del cáncer.
Para comenzar, una el bloque PDMS al chip perforando agujeros en el bloque PDMS para los puertos de entrada y salida con una aguja hueca de un milímetro de diámetro. Luego coloque los bloques PDMS y el chip con la parte posterior hacia arriba en un limpiador de plasma durante un minuto. Después de alinear los orificios de los bloques PDMS con la entrada y salida del chip, presione suavemente los bloques PDMS contra el chip durante 15 segundos, lo que dará como resultado una unión entre los bloques PDMS y la superficie del chip.
Para conectar el catéter de PTFE al chip, corte dos piezas de catéter con un diámetro interior de 0,8 milímetros y una longitud de 10 centímetros. Doble una aguja de acero inoxidable con un diámetro interior de 0,7 milímetros y una longitud de 1,5 centímetros por 90 grados en forma de L y conéctela a un extremo del catéter. Inserte las agujas de acero inoxidable en los orificios de los bloques PDMS.
Para la entrada, conecte una aguja dispensadora de calibre 19 al otro extremo del catéter como conector para una jeringa. Luego, inyecte agua desionizada para probar la estanqueidad del canal general. Para un conjunto de cerámica piezoeléctrica, seleccione láminas cerámicas piezoeléctricas precortadas con un ancho de cinco milímetros.
Luego suelde los cables en ambos lados de la cerámica piezoeléctrica en un extremo. Pegue la cerámica piezoeléctrica al centro de la parte posterior del chip colocando una gota de pegamento de cianoacrilato sobre la cerámica piezoeléctrica. Alisar el pegamento con el palillo y retirar el exceso de pegamento.
Luego presiónelo rápidamente en el chip y continúe presionando durante aproximadamente un minuto. Para montar el microdispositivo, corte un trozo de PDMS como base del microdispositivo y pegue un lado de la base a los bloques PDMS de entrada y salida y el otro lado a una diapositiva de vidrio transparente con cinta adhesiva de doble cara. Fije todo el microdispositivo a la etapa del microscopio para mantener el chip en un plano focal.
Para preparar las soluciones de partículas estándar de poliestireno, agregue 0.05 mililitros de solución de partículas de poliestireno a 10 mililitros de PBS y mezcle bien. Luego prepare las suspensiones celulares lavando las células adherentes al 90% de confluencia con PBS. Añadir 500 microlitros de 0,25 tripsina durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.
Después de eliminar la tripsina, agregue un mililitro de medio completo y forme una suspensión celular por pipeteo. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 100 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 0.5 a un mililitro de PBS para obtener una suspensión celular.
Luego las células se contaron con un hemocitómetro y la concentración fue de aproximadamente 300 a 500, 000 células por mililitro. Después de una preparación de la suspensión del núcleo celular como se demostró anteriormente, retire el sobrenadante y agregue 200 microlitros de reactivo de extracción de proteínas citoplasmáticas A por cada 20 microlitros de paleta celular y mezcle bien. Luego vortex la mezcla anterior a 220 G durante cinco segundos y colóquela en un baño de hielo durante 10 minutos.
A continuación, agregue 10 microlitros de reactivo B de extracción de proteínas citoplasmáticas a la solución después de la incubación. Después del vórtice, coloque en baño de hielo durante un minuto y vuelva a vorámice a 220 G durante cinco segundos. Luego, finalmente centrifugar a 1000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y vuelva a suspender la paleta en un mililitro de PBS. Luego centrifugar a 1000 G a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspender en 100 microlitros de PBS como suspensión del núcleo celular.
Agregue azul de tripano a la suspensión del núcleo celular anterior y tiñe a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, cuente el número de núcleos bajo el microscopio invertido con un objetivo de 10x. Diluir la suspensión del núcleo celular anterior con tampón PBS a una concentración de 200 a 300, 000 núcleos por mililitro.
Luego filtre la suspensión del núcleo celular a través de un tamiz de 70 micrómetros. Para configurar el sistema de medición, encienda la fuente de luz del microscopio y abra el software de la cámara. Utilice el objetivo 4x para encontrar la posición media del microcanal, es decir, la posición de la cerámica piezoeléctrica.
Después de conectar los cables, suéldelos a los terminales positivo y negativo de la salida del generador de señal de la cerámica piezoeléctrica, respectivamente. Luego coloque la jeringa en la bomba de microinyección y conéctela al catéter de entrada. Para recoger el líquido del microcanal, coloque un recipiente pequeño en el extremo del catéter de salida.
Para determinar los parámetros de medición, aspire la solución de partículas de poliestireno con la jeringa. Luego inyecte la solución en el microcanal del chip evitando las burbujas de aire y en el microcanal del chip para garantizar una medición precisa. Ajuste la salida del generador de señal a una señal de señal con una frecuencia de un megahercio y un voltaje pico a pico de 10 voltios hasta que se observe que las partículas se mueven hacia la línea media del microcanal y permanecen en movimiento hacia adelante a lo largo de la línea media después de alcanzar la línea media.
Después de mezclar una suspensión de células o núcleos de mililitro con la solución de partículas estándar en la proporción de uno a uno, inyecte en el microcanal con una jeringa para medir células y núcleos. Comience a grabar con la cámara CCD cuando las células o núcleos entren en el campo de visión y encienda el generador de señales. Luego enjuague el microcanal con agua desionizada, alcohol al 75% y agua desionizada en secuencia para su uso posterior.
El movimiento de las células y partículas se observó bajo la acción de la fuerza del campo acústico hacia la línea media del microcanal en diferentes intervalos de tiempo. Se realizó el cálculo de energía, densidad y compresibilidad celular y se obtuvo la densidad de energía acústica y la trayectoria de movimiento medida para la partícula a partir del resultado de mejor ajuste. La alta pureza y los núcleos intactos se aislaron de las células y la medición de la compresibilidad del núcleo se logró obteniendo la trayectoria de movimiento del núcleo.
Se midió y comparó la compresibilidad de diferentes tipos de células cancerosas y células después de la EMT inducida por fármacos o la irradiación de rayos X con diferentes dosis. Se recolectaron las células medidas y se encontró que no hubo diferencias significativas en la proliferación celular y la viabilidad en comparación con el grupo no tratado después de 48 horas de cultivo. Indica que la medición de la compresibilidad no tiene ningún efecto sobre la proliferación y supervivencia celular.
Lo más importante es afinar la frecuencia de la señal hasta que se observe que las partículas se mueven hacia la línea media del microcanal.
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