人間の膵島単離:パートI:膵組織の消化とコレクション

Biology

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Summary

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順:変更された自動化法を用いて(パートI消化および膵組織のコレクション)。

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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

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Abstract

1型糖尿病の管理は、年間1,000億ドルで、個人と社会の両方に、厄介です。グルコースモニタリングと新しいインスリン製剤の普及にもかかわらず、多くの個人はまだ壊滅的な二次的合併症を開発する。膵島移植は、糖尿病患者における正常血糖コントロールの近くに復元することができます

Protocol

1。ファシリティのセットアップ

  1. 人間の膵島分離には、チームワークを含む時間に敏感な手順であり、それゆえ、4人は、この手順を行うことが必要である。チームは、膵臓の解剖とcannulates外科医によるリードです。
  2. 膵島分離は、チームはUIC膵島分離施設に入る分を開始します。チームメンバーは、必要なすべての計測機器が、遠心分離機のように、チェックされており、電源が入っていることを確認してください。彼らはまた、すべてのフードとの表面を適切にサニタイズしてください。
  3. 二人は、カニューレ挿入のテーブル、スラッシュ自販機、消化回路、灌流装置、COBE浄化機、および外科テーブルを設定します。
  4. 同時に、他の2つのチームのメンバーは、分離時に必要なメディアを準備します。
  5. 次に、細菌学のチューブ(ボトル、チューブ、フォームおよび袋)、サンプリングチューブ(洗浄とプレ充填)、及び評価のチューブとプレートが用意されています。
  6. 次のように設定された浄化チューブを準備します:第1回チューブ、空、150 mlでマーク、チューブ2-12は、ヒトアルブミン(洗浄ソリューション)を添加したM199培地200mlで埋め、230 mlでマークされ、そして最終的に1つ50 mlコニカルチューブ洗浄溶液50mlでいっぱい。これらの準備ステップが完了すると我々は、膵臓を作製し、灌流を開始する準備ができました。

2。膵臓の準備と血流

  1. 膵臓の準備と灌流を開始するには、演算子は、滅菌テクニックを使用してパッケージから臓器を削除します。外科医は、汚染除去のテーブルに膵臓を転送します。
  2. 外科医はそれは準備された"調達"細菌学のボトルを埋めるために、それを使用する演算子、にオリジナルの膵臓保存液と手を使用すると、ワン60mlのシリンジを満たします。
  3. 臓器は、膵島分離(膵臓が調達ま​​たは解剖学的に異常な中に破損している場合、それは膵島分離に使用されていない可能性があります)に適しているかどうかを判断するために目視検査の後、外科医は、コラゲナーゼを準備するためにオペレータが要求されます。この再懸濁の時間が異なる酵素のブランドと多くの間で変化することに注意してください。
  4. 外科医の準備が整うと、汚染除去のテーブルに(Betadine、Fungizone /セファゾリンおよびHBSS)除染ソリューションを持参し、適切なコンテナにそれらを注ぐ。外科医は、分間除染液の各々に膵臓を洗浄する膵臓の汚染除去を行います。膵臓は、それは重量を測定されるに小さい殺菌した瓶に入れられます。重量は、バッチレコードに入力された後、膵臓は、いくつかの保存液とカニューレのパンに配置されます。
  5. 外科医は、公開と部分的に主膵管を切開すると、カニューレと膵臓の各半分をカニューレを挿入するでしょう。カニューレは、縫合によって固定されます。膵臓を灌流するには、まず血流のユニットに移動し、流域に酵素液を注ぐ。総灌流時間は約10分、5分では80 mmHgの時、その後5分間で180 mmHgの時です。膵臓は灌流後に膨張した。
  6. 脂肪組織が慎重に膵臓からトリミングされているカニューレのパンへの灌流膵臓を、移動する。その後10から12の部分に膵臓をカットし、消化のためにRicordiの商工会議所に移す。

3。膵臓の消化

  1. 、消化のステップを開始する空のRicordiのチャンバーに膵臓を転送、Pulmozymeの1つの2.5 mlのバイアルを追加するには、(チャンバーを組織ブロックの大きな塊を避けるために)画面に置かれた、チャンバーを閉じ、システムをいっぱいに。
  2. 5分間のソリューションをポンピング開始。ゆっくりと均等に全体の温溶液を分散させるためにチャンバーを揺らし。 5分後、軽く全体の消化の段階のためのチャンバーを振る。 ˚Cで37℃の温度を維持する
  3. 温度が37℃に達するまでゆっくりとチャンバーを揺する、その後チャンバーを振る。サンプルを2分ごとに乗り、無料の島が、スコープの下に発見された場合に検出。バッチ記録の消化テーブル内の膵島評価情報を記録します。そのうちの50%が溶液中に遊離し、分離されたフローティングがあるまで、膵島の割合を監視し続ける。

4。組織のコレクション

  1. かつて島の50%がサンプル中の遊離発見された、消化が回路内にコールドRPMI希釈液を加えることによって停止されます。組織を、500mlコニカルチューブヒトアルブミン30mlで事前入力で収集されます。一度チューブは、スピン清オフ吸引と冷洗浄溶液でペレットを洗浄している。 1分、4˚Cの、1100 RPM(毎分回転数)でコニカルチューブをスピン
  2. シングル500ミリリットルコニカルに消化された膵臓の組織で中断されたすべてのコレクションチューブを組み合わせる。チューブは洗浄された組織の一杯になると、スピンし、すべての組織が複数回洗浄されるまで、洗浄工程を繰り返します。このチューブをスピンし、単一の250ミリリットルコニカルチューブに組織を移す。 250mlにボリュームをで持ち出すM199洗浄ソリューションでは、HAを補充し、サンプリングの準備。
  3. ピペットで1 mlのサンプルを取り、15 mlコニカルチューブ洗浄溶液9 mlをあらかじめ入力して追加します。その後、皿を数える直接グリッドに1ミリリットルからのサンプル、15 mlコニカルチューブゆるやかに転倒によって、本から混ぜる。細胞をカウントし、2500(10x250)の希釈係数を用いて細胞数を計算する。
  4. 250ミリリットルコニカルチューブをスピンし、UW(ウィスコンシン大学)は、通常、臓器温存のために使用する溶液の150mlを加える。 UWが追加されたときに、ピペットを用いて細胞懸濁液を混ぜる。 UWの開始時刻を記録し、精製のオペレータに通信する。氷と時折渦巻きにチューブ(s)を残す。今すぐ島をさらに精製することができる。

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Discussion

分離の結果9,10に影響を与える要因はさまざまです。その中で、膵組織の消化は、重要な役割を果たしている。私たち自身の人間の膵島分離の経験に基づいて、我々は潜在的に膵島の収量と品質に影響を与えうる重要なポイントは、以下の要約。

  1. 酵素の様々なタイプが使用されると消化時間が異なっている。
  2. 早く完全に腺房組織から分離膵島の40〜50%として、消化が希釈溶液を添加し、組織を冷却することによって直ちに停止する必要があります。
  3. 穏やかな収集組織の処理、洗浄、そして混合。
  4. 収集された組織とUW液の混合物が良い精製結果を得るために少なくとも30分間氷上に置く必要があります。

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Acknowledgments

イリノイ大学シカゴ校だけでなく、膵島細胞リソースセンターNIHの助成金(RFA - RR 05から003)、クリストファー財団、Efroymson財団、およびテラブス財団からの資金によって支え。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

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References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).

Comments

9 Comments

  1. Nice video, Barbara. I learned a lot.

    Tatsuya from Edmonton

    Reply
    Posted by: Tatsuya K.
    May 28, 2009 - 7:34 PM
  2. Thank you tatsuya

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 7:45 PM
  3. i am from taiwan, a transplant surgeon. it is very impressive to see this video and really learn a lot! appreciate your kindly share!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 12:28 PM
  4. if you want to learn, please let us know. Really appreciate your comments. Yong

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 1:02 PM
  5. I also think this video is very helpful. I just joined as a research assistant at an islet transplant lab in Canada. I just wish I could download the movie to view it more often.

    Reply
    Posted by: Marco G.
    October 31, 2010 - 7:20 PM
  6. Thanks for your comments. You can subscribe and download the movie from the web.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2010 - 10:07 AM
  7. Great video! Definitely very helpful in visualizing the protocol. Are you able to provide any additional information on the perfusion unit set up?

    Reply
    Posted by: Brooke L.
    December 12, 2012 - 11:50 AM
  8. Hello Brooke L, thank you so much for sending this massage and being interested in our human islet isolation protocol. I can certainly provide more information and discuss the perfusion unit set up. Please send us an email about what exactly you want to know. We are happy to give more explanations. Thanks

    Reply
    Posted by: Meirigeng Q.
    December 12, 2012 - 2:44 PM
  9. Hi, really nice video. I´m from Brazil and we are close to start our Islet Transplant Program. Still struggling with some issues in the isolation phase.
    I have a question. When you prepare the colagenese do you use Pulmozine together and also in the chamber?
    And the ficoll is prepared with HBSS or UW or Eurocollins?
    Thank you
    I appreciate your help.

    Reply
    Posted by: Andrea Carla B.
    August 15, 2014 - 9:45 AM

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