Mesoscopic प्रतिदीप्ति के लिए टोमोग्राफी में इन विवो विकसित करने की इमेजिंग ड्रोसोफिला

Biology

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Summary

Mesoscopic प्रतिदीप्ति टोमोग्राफी ऊतक सेक्शनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के प्रवेश सीमाओं से परे चल रही है. तकनीक बहु प्रक्षेपण रोशनी और एक फोटान परिवहन वर्णन पर आधारित है. हम में vivo पूरे शरीर के morphogenesis 3 डी दृश्य GFP-व्यक्त विंग imaginal डिस्क का प्रदर्शन

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Vinegoni, C., Razansky, D., Pitsouli, C., Perrimon, N., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila. J. Vis. Exp. (30), e1510, doi:10.3791/1510 (2009).

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Abstract

Protocol

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर इस प्रयोग में इस्तेमाल किया शेयरों में निम्नलिखित हैं :

  • elav Gal4 (FBti0002575)
  • एपी Gal4md544 (FBal0051787)
  • यूएएस srcEGFP (FBti0013990)
  • w1118 (FBal0018186)

सभी प्रयोगों के लिए, सिस्टम यूएएस Gal4 ब्याज के ऊतकों (यानी लार की गिल्टी या दक्षिणपंथी डिस्क) में overexpress GFP के लिए इस्तेमाल किया गया था. अधिक विशेष रूप से, महिला उपयुक्त Gal4 साथ ट्रांसजेनिक मक्खियों यूएएस-EGFP ट्रांसजेनिक साथी को पार कर रहे थे. पार 25 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में पाला गया. जब pupae शीशियों (लगभग 5-6 दिनों के पार की दीक्षा के बाद) populating शुरू, वे GFP प्रतिदीप्ति के लिए सफेद prepupal चरण (puparium गठन के बाद 0-1 घंटा) में चयन किया गया था और टोमोग्राफी इमेजिंग के लिए एकत्र की.

  1. 25 में उचित पार और पीछे सेट डिग्री सेल्सियस
  2. 5-6 दिनों के पार की दीक्षा के बाद, इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट संतान का चयन करें. शीशी की तरफ से सफेद prepupae की कोमल हटाने के लिए एक गीला तूलिका का प्रयोग करें.
  3. पानी या पीबीएस की एक बूंद में prepupae रखो एक पेट्री डिश में रखा करने के लिए खाद्य कणों और गोंद है कि pupal मामले शामिल हैं और नमूना autofluorescent बनाता है हटाने. धीरे एक तूलिका के साथ साफ. यदि pupae की उम्र बढ़ने के लिए आवश्यक है, जगह एक गीला कागज तौलिया के साथ (एक नम कक्ष) या उड़ भोजन के साथ एक साफ शीशी के पक्ष में एक पेट्री डिश में सफेद prepupae चयनित. यह है कि वहाँ पर्याप्त नमी है सुनिश्चित करने के लिए, जानवर के समुचित विकास की अनुमति देगा.

ड्रोसोफिला बढ़ते

  1. गोंद एक केशिका ग्लास ट्यूब (800 माइक्रोन व्यास) में pupal मामले के नीचे हिस्से ऐसी है कि मक्खी / पूर्वकाल पीछे अक्ष समानांतर ट्यूब को उन्मुख है.
  2. ठीक केशिका ट्यूब खड़ी एक घूर्णी मंच पर.
  3. घूर्णी के लिए इमेजिंग सीसीडी पिक्सेल कॉलम समानांतर अक्ष के लिए आदेश में घूर्णी चरण के झुकाव अक्ष को समायोजित करें.

निर्धारण फॉरवर्ड मॉडल

  1. ठीक एक केशिका गिलास में एक कोषस्थ कीट और माउंट के रूप में पहले वर्णित
  2. एक फ्लोरोसेंट रंजक (Cy5.5) के साथ एक सिलिका केशिका ट्यूब (100 माइक्रोन, आयुध डिपो) भरें
  3. कोषस्थ कीट के अंदर 45 डिग्री पर अक्ष / पूर्वकाल पीछे करने के लिए सम्मान के साथ केशिका ट्यूब डालें
  4. कोषस्थ कीट के साथ एक कम संख्यात्मक एपर्चर लेंस के साथ एक उत्तेजना लेजर बीम रोशन. 360 कोषस्थ कीट अपनी ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ घूर्णन डिग्री से अधिक प्रतिदीप्ति transillumination छवियों को ले लीजिए.
  5. एक उपयुक्त आगे मॉडल के साथ प्रयोगात्मक डेटा को फ़िट

इमेजिंग लार की गिल्टी

  1. लार के रूप में पहले वर्णित ग्रंथियों में माउंट एक कोषस्थ कीट व्यक्त GFP
  2. एक उत्तेजना किरण के साथ रोशन और transillumination में 360 कोषस्थ कीट अपनी ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ घूर्णन डिग्री से अधिक GFP प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा.
  3. अधिग्रहीत आगे मॉडल का उपयोग डेटा फिर से संगठित

समय - चूक इमेजिंग

  1. विंग imaginal डिस्क में माउंट एक सफेद prepupa व्यक्त GFP
  2. इमेजिंग आर्द्र वातावरण और कमरे के तापमान पर कोषस्थ कीट की निर्जलीकरण से बचने के रखें.
  3. सतत रोशनी से बचने के एक शटर प्लेस
  4. एक उत्तेजना किरण के साथ रोशन और transillumination में 360 कोषस्थ कीट अपनी ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ घूर्णन डिग्री से अधिक GFP प्रतिदीप्ति संकेत इकट्ठा.
  5. अधिग्रहीत आगे मॉडल का उपयोग डेटा के पुनर्निर्माण.

प्रोटोकॉल

  1. लार की गिल्टी 1x पीबीएस में सीएनएस / आँख डिस्क काटना.
  2. 4% Formaldehyde, कमरे के तापमान पर 20min के लिए 1x पीईएम (100mm पाइप्स, 1mm EGTA, 1mm MgCl 2) में ऊतकों को ठीक करें.
  3. निर्धारण और Vectashield में माउंट dapi (वेक्टर) के साथ निकालें
  4. एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ छवि.

समय - चूक प्रोटोकॉल

  1. सफेद prepupae लीजिए और उन्हें एक नम कक्ष में मंच.
  2. विभिन्न विकासात्मक चरणों में pupae ले लीजिए
  3. चुभन pupal दो बार (कीट 000 पिन, FST) निर्धारण से पहले एक ठीक सुई के साथ मामले (Puparium गठन के बाद 0 घंटे).
  4. कोमल आंदोलन के साथ 6-8 बजे के लिए कमरे के तापमान पर 8% Formaldehyde, 1x पीईएम में pupae फिक्स.
  5. निर्धारण के हटाने के बाद और 1x पीबीएस के साथ rinsing, एक तेज ब्लेड के साथ दो टुकड़ों में तय कोषस्थ कीट कटौती ए / पी अक्ष को सीधा;
  6. डूब (वेक्टर) dapi और माउंट के साथ दो Vectashield में coverglass स्लाइड्स पर इमेजिंग के लिए टुकड़े (लैब - टेक).
  7. एक प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन के साथ छवियों का मोल.

1 आंकड़ा
चित्रा 1 कृपया यहाँ क्लिक करने के लिए अल देखसंख्या 1 के arger संस्करण.

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Discussion

में vivo pupal मामले के पुनर्निर्माण और एक डी के GFP-व्यक्त लार की गिल्टी इसी ऊतक विज्ञान (नीले, dapi धुंधला, हरे, GFP प्रतिदीप्ति) के साथ मेलानोगास्टर prepupa (स्केल पट्टी, 500 microns) 1 अंजीर में दिखाया गया है (एक). समय चूक डी. की श्रृंखला इमेजिंग मेलानोगास्टर विंग imaginal डिस्क Fig.1 में दिखाया गया है (ख) है. छवियों को एक एकल रहते नमूना से अर्जित कर रहे हैं, चार अलग अलग समय अंक (0,3.0, 3.5, और 6.5 घंटे) पर. कोषस्थ कीट पृष्ठीय देखने के लिए सम्मान के साथ प्रथम स्तंभ 0 डिग्री पर प्रक्षेपण में दिखाया गया है. दूसरे स्तंभ में पुनर्निर्माण लाल रेखाओं द्वारा दर्शाई वर्गों के अनुरूप है. अंत में, ऊतक विज्ञान के साथ तुलना तीसरे स्तंभ दिखाया गया है. जाहिर है, histological तैयारी tomographic पुनर्निर्माण के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधी. (ग) एक ड्रोसोफिला pupal मामले और GFP-व्यक्त लार ग्रंथियों के planar छवि में.

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Acknowledgments

सी. Vinegoni स्वास्थ्य (NIH) 1-RO1 - EB006432 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन मानता है.

References

  1. Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat. Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
  2. J, Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  3. Dodt, H. U. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
  4. Vinegoni, C. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Nat. Methods. 5, 45-47 (2008).

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