Beredning av poolade humana trombocyter lysat (pHPL) som en effektiv Tillägg för Animal serumfritt mänskliga kulturer Stem Cell

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Mänskliga trombocyter lysat är en rik källa av tillväxtfaktorer och ett potent tillskott i cellkultur. Detta protokoll visar att förbereda en stor pool av mänskliga trombocyter lysat genom att utgå från trombocyter rich plasma, utför flera frys-tö cykler och en uttunning av trombocyter fragment.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schallmoser, K., Strunk, D. Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures. J. Vis. Exp. (32), e1523, doi:10.3791/1523 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Trombocyter derived growth faktorer har visat att stimulera celltillväxt effektivt

Protocol

1. Utgångsmaterial

Börja med trombocyter rich plasma (PRP) enheter som utarbetats av cytapheresis eller härrör från buffy rockar.

2. Sterilitet kontrollera

För sterilitet kontrollera att ta ett prov på 20 ml från varje PRP enhet genom att överföra volymen till en ansluten liten väska (Baxter). Koppla denna väska genom svetsning.

3. Frysning av PRP enheter

Omedelbart efter beredning, frysa PRP enheterna ned till minst -20 ° C i originalförpackningen förvaringsväska utan vidare manipulation.

4. Upptining av HPL enheter

När bakteriella tester är negativa, tina mänskliga trombocyter lysat enheter, som nu kallas HPL enheter vid 37 ° C (vattenbad) tills isen blodproppar försvinna. Värm inte HPL.

5. Sammanslagning av HPL enheter

Ta med minst tio till femton tinas HPL enheter för ett trombocyter lysat bassäng för att förbereda en standardiserad produkt. Anslut HPL påsar i följd för sammanslagning dubbla påsen (MacoPharma) och överför HPL i dessa två väskor. Koppla bort den tomma HPL väskor genom svetsning. Skaffa en slutlig volym på 3 till 4 L av poolade humana trombocyter lysat (pHPL) genom att blanda innehållet i två väskor. Anslut en liten väska (Baxter) och ta ett prov på 20 ml pHPL för sterilitet kontroll av poolade produkten. Koppla denna väska genom svetsning.

6. Portionering av pHPL

Del av pHPL att få lämpliga alikvoter för vidare bearbetning. Anslut små påsar (Baxter) till sammanslagning dubbla påsen (MacoPharma) och överföring volymer på upp till 250 ml till de små förvaringspåsar (Baxter). Koppla den fyllda påsar genom svetsning.

7. Re-frysning av pHPL alikvoter

Öka graden av blodplättar fragmentering och mängden utsläppt tillväxtfaktorer med ytterligare frysning / tina steg. Frysa små påsar med portionerade pHPL igen på minst -20 ° C.

8. Re-upptining och portionering av pHPL alikvoter

Tina pHPL väskor vid 37 ° C (vattenbad). Överför innehållet till 50 ml injektionsflaskor (Falcons BD) genom att skära röret i påsen med steril sax och hälla pHPL i injektionsflaskor. Utför detta steg i ett laminärt flöde bänk för att undvika bakterie-eller svampinfektioner kontamination.

9. Borttagning av blodplättar fragment

Eftersom trombocyter fragment tenderar att aggregera och kan framkalla alloimmunisering, ta bort dem från pHPL. Centrifugera pHPL flaskorna därför vid 4000 g (15 minuter, 4 ° C). I ett laminärt flöde bänk pipett supernatant plasma till slutförvar flaskor (Falcons BD) och släng trombocyter pellets för att undvika fragment i cellkultur.

10. Lagring av pHPL

Freeze alikvoter av 50 ml pHPL ampullerna igen minst-20 ° C och lagra dem för experimentell användning.

11. Användning av pHPL i cellodling

Inledningsvis lägger konserveringsmedel heparin till mediet för att undvika gel bildas. Tina en pHPL alikvot vid 37 ° C och komplettera odlingsmediet genom tillsats av 8 - 10%.

Medier

MSC-Medium:

Använd 500 ml a-MEM, tillsätt 56 ml av den upptinade pHPL (se även referens 1 för ytterligare information) och 2 IU / ml (= 224 ìl av stamlösning) av konserveringsmedel Heparin (undviker koagulering av mediet genom klumpar av fibrinogen i plasma) för att nå en slutlig koncentration på 10% pHPL. Dessutom lägger Penicillin (100U/mL) / streptomycin (100μg/mL) lösning och 2mm av L-Glutamin (båda Sigma).

Filtrera medium genom en 20 m-porstorlek vakuumfilter (Millipore). Märk flaskan lämpligt (innehåll, datum).

ECFC-Medium:

Använd en flaska (500 ml) av EBM, lägg till cytokin-alikvoter, 56 ml pHPL, 10 IE / ml (= 1120μl av stamlösning) av konserveringsmedel Heparin, penicillin (100U/mL) / streptomycin (100 g / ml) och 2mm av L-Glutamin för att bassubstratets och filter med en 20 l-porstorlek vakuumfilter (Millipore). Märk flaskan lämpligt (innehåll, datum).

Figur 1
Figur 1: Förberedelse av platelet-rich plasma från helblod donation från en lokal blodbank eller någon annan godkänd leverantör. Efter centrifugering blodet kan delas upp i plasma, buffy coat och röda blodkroppar. Fyra buffy coat enheter, blodgrupp O och en blodgrupp AB plasma kan samlas innan centrifugering för att separera trombocyter rich plasma. En vanlig kvalitet platelet-rich plasma enhet på ca 300ml bör innehålla 1x10 9 trombocyter per ml eller 3x10 11 platelets totalt.

Figur 2

Figur 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vissa regioner trombocyter rich plasma (PRP) kan erhållas från buffy-rockar annars vara en restprodukt av packade röda blodkroppar från undersökta blod (Figur 1). Optimalt är PRP användas omedelbart för vidare beredning av pHPL, som i föråldrade blodplättar koncentrerar tillgängligheten av tillväxtfaktorer kan minskas på grund av trombocyter lagring skador och nedbrytning 20. Det rekommenderas vidare att producera PRP genom att matcha trombocyter av blodgrupp O med plasma av blodgrupp AB för att undvika eventuell påverkan av ABH antigener och isoagglutinins. Hittills har cellkulturer används mest fetalt bovinserum (FBS) som bär risken för xenoimmunization 21 och överföring av kända och okända patogener. Alternativ som autologa serum eller serum-fria medier ännu inte lyckas ersätta FBS i många applikationer. 22 I tidigare studier har vi jämfört effekterna av pHPL och FBS på expansion av mesenkymala stromaceller avslöjar en verkningsgrad på pHPL i cell förökning. 7,8,23 Isoleringen och storskalig expansion av endotelceller stamceller i djur serumfritt förhållanden in EGM-2 kompletteras med pHPL har visats av Reinisch et. al. 11 och är dessutom presenteras som en JUPITER protokoll av Nicole A. Hofmann. Protokollen för att förbereda MSC och ECFC förberedelser medelstora beskrivs i figur 2 och 3.

Användningen av pHPL som en potent ersättning för FBS utgör en attraktiv steg mot ett djur serumfritt Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatibel utvecklingen av Cell Therapeutics för klinisk tillämpning. 9,24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete har fått stöd av den österrikiska Research Foundation (FWF, bevilja N211-NAN till DS) och den österrikiska Research Promotion Agency (FFG bevilja N200 till DS). Författarna tackar Claudia Url för utmärkt tekniskt bistånd och Monica Farrell för språklig redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double bag (2 x 3.5L) MacoPharma VDL 8000XQ originally for ascites puncture
50 mL Falcon tube Falcon BD 2098
50 mL Stripettes Costar 4501
Plasma bags (600mL) Baxter Internationl Inc. R4R2021
Sterile tubing welder Terumo Medical Corp. TSCD-II
Welding equipment Fresenius Kabi Compo Seal
Water bath
Sterile scissors
Clamps
Centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
  2. Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).
  3. Giacco, F. Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1. FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).
  4. Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue. Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).
  5. Kakudo, N. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts. Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).
  6. Doucet, C. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).
  7. Schallmoser, K. Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells. Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).
  8. Reinisch, A. Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application. Regen Med. 2, 371-382 (2007).
  9. Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part. C Methods. 14, 185-196 (2008).
  10. Lange, C. Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).
  11. Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. 113, 6716-6725 (2009).
  12. Bernardo, M. E. Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).
  13. Carrancio, S. Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification. Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).
  14. Muller, A. M. Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue. Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).
  15. Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields. Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).
  16. Anitua, E. New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies. Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).
  17. Martinez-Zapata, M. J. Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review. Transfusion. 49, 44-56 (2009).
  18. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).
  19. Frechette, J. P., Martineau, I. &, Gagnon, G. Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing. J Dent Res. 84, 434-439 (2005).
  20. Seghatchian, J., Krailadsiri, P. The platelet storage lesion. Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).
  21. Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions. Blood. 89, 776-779 (1997).
  22. Tonti, G. A., Mannello, F. From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera. Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).
  23. Bieback, K. Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow. Stem Cells. (2009).
  24. Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality. Gad, S. C. John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).

Comments

7 Comments

  1. I wonder if you know any company that could prepare and sell us the human platelet extract to be used for experimental work. Thank you very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 28, 2011 - 4:27 PM
  2. The pHPL should be commercially available before summer. Pls send an inquiry to sca1@gmx.net to be processed within the next weeks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2011 - 3:00 AM
  3. can we process freeze thaw the platelet lysate and store them at -²0C for future use. Will this freeze thaw cycle affect growth factors? will this PL be viable up-to a month?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 8:10 AM
  4. We freeze PL samples routinely at -²0 to -30°C under the avoidance of repeated thaw/freeze procedures, efficient stimulation of cell proliferation in culture was proven after a storage period of app. ² years at -30°C.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 8:33 AM
  5. Thank-you for your reply.

    I have a another question,:

    1. We basically freeze thaw platelets (1st time) and aliquotes in 50 ml tubes and then stored in -80C.
    After this we process ² to 3 rounds of freeze thaw cycle before using in MSC cultures. My question is can we process this ² to 3 rounds of freeze thaw cycle in advance say a month prior use (for MSC culture)? Or is it efficient to freeze thaw (² to 3 rounds) before the day of the MSC culture experiment.
    Which method do you think is more efficient for cell proliferation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 8:52 AM
  6. Probably this variation will not make a measurable difference, but to get sure you have to compare, otherwise it is philosophical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 9:29 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics