के अलगाव और शुद्धीकरण ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स चुंबकीय मनका छंटनी द्वारा

Biology

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Summary

इस वीडियो लेख में हम अलगाव और शुद्धि के लिए एक विधि प्रस्तुत

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Iyer, E. P., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting. J. Vis. Exp. (34), e1599, doi:10.3791/1599 (2009).

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Abstract

Protocol

ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स के चुंबकीय मोतियों की छंटनी पर जनरल टिप्पणियाँ (प्रोटोकॉल के समापन के लिए कुल समय: 2.5-3 घंटे)

एक साफ, RNase मुक्त वातावरण बनाए रखने के लिए मानक प्रयोगशाला प्रक्रियाओं हर समय मनाया जाना चाहिए आरएनए गिरावट को रोकने के.

जब ड्रोसोफिला लार्वा छल्ली dissected और सेल हदबंदी बफर में रखा है, परिधीय न्यूरॉन्स पिछले कोशिकाओं की छल्ली से अलग कर रहे हैं . हम इस संपत्ति का शोषण किया है और इस प्रोटोकॉल डिजाइन मांसपेशियों और पहले दा न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए वसा के रूप में छल्ली से गैर विशिष्ट कोशिकाओं के सबसे हटा.

अभ्यास के साथ, पूरे प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक लगभग 2.5 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है. एंटीबॉडी लिपटे मोतियों के तैयार होने से पहले प्रयोग शुरू होता है पूरा किया जाना चाहिए.

1. बंधन कक्ष के लिए चुंबकीय मोतियों की तैयारी:

इस कदम का प्रयोग शुरू करने के लिए पहले पूरा किया जाना चाहिए. तैयार माला और तैयार किया जा सकता है संग्रहीत 4 बजे डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक है.

  1. यह ताजा पीबीएस के 500 μl में resuspending और यह एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र में हर बार pelleting Dynabeads M-280 streptavidin लेपित पीबीएस में तीन बार मोती के 100 μl धो लें.
  2. अंत में मोती सीधे resuspend undiluted biotinylated चूहे विरोधी माउस CD8a एंटीबॉडी (एंटीबॉडी एकाग्रता 100 μg / एमएल) की 100 μl में.
  3. कभी कभी हल्के अवसादन रोकने के vortexing के साथ बर्फ पर 1 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं. [एम 280 Dynabeads की 1 μl biotinylated एंटीबॉडी के 0.05-0.10 μg बाइंड कर सकते हैं].
  4. मनका - प्रतिरक्षी मिश्रण तीन बार के रूप में 1.1 चरण में वर्णित के लिए अतिरिक्त एंटीबॉडी हटाने धो लें. चुंबकीय मोतियों अब एंटीबॉडी के साथ लेपित हैं और के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. 1X पीबीएस के 100 μl में 4 पर मनका - प्रतिरक्षी मिश्रण ° उपयोग करें जब तक सी स्टोर.

2. चयन और वॉशिंग लार्वा: (10-15 मिनट)

  1. 30-50 आयु मिलान तीसरे instar लार्वा उठाओ और एक 1.6ml microfuge ट्यूब में उन्हें 1X फास्फेट के 1-1.2 मिलीलीटर के साथ जगह खारा (पीबीएस) buffered. (3-5 मिनट)
  2. ट्यूब और एक एक दूसरे के लिए यह अधिकतम सेटिंग में भंवर तीन बार बंद करें.
  3. आग पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दोहराएँ धो (2.1) और भंवर (2.2) 3-4 बार कदम जब तक सतह पर तैरनेवाला जाहिरा तौर पर किसी भी खाद्य कणों और मलबे के स्पष्ट है.
  4. संक्षेप में 70% इथेनॉल 1 मिलीलीटर के साथ धोने दोहराने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  5. लार्वा धो ddH2O के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  6. संक्षेप धोने RNase दूर 1 मिलीलीटर के साथ एक बार फिर दोहराने और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  7. लार्वा ddH2O के 1 मिलीलीटर में तीन बार धो RNase दूर की पूरी हटाने को सुनिश्चित करने.

3. विच्छेदन: (10-12 मिनट)

  1. जगह एक Sylgard लेपित 35 मिमी पेट्री प्लेट के केंद्र पर 10-12 लार्वा. उन्हें थोड़ा एक दूसरे से दूर स्थिति. [महत्वपूर्ण कदम: किसी भी लार्वा है कि उचित विकास के चरण में होना प्रतीत नहीं त्यागें]
  2. सभी लार्वा के लिए ठीक विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग लार्वा के पूर्वकाल टिप खुला कट.
  3. सुस्त लार्वा के अंदर - बाहर पलटना Dumont नहीं 5 संदंश की एक जोड़ी का उपयोग. लार्वा छल्ली के अंदर एक forcep पीछे अंत तक सभी तरह डालें. संदंश के सुझावों को एक साथ चुटकी छल्ली (चित्रा 1a) (छल्ली दबाकर नीचे Sylgard की सतह पर इसे आसान बनाने के प्रयास करें) के पीछे अंत हड़पने. संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग, बाहर अंदर लार्वा छल्ली धक्का. [महत्वपूर्ण कदम: इस विधि सेल अलगाव प्रयोग करने का प्रयास करने से पहले एक बार कुछ अभ्यास का प्रयास करें. पूरी तरह उलटा लार्वा पाने की कोशिश करो, करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोमल ऊतकों आसान हदबंदी के लिए समाधान के लिए संपर्क कर रहे हैं.]
  4. 3-4 लार्वा विदारक बाद उन्हें तुरंत एक 1.6 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में ताजा, ठंडा पीबीएस (बर्फ पर ट्यूब जगह) करने के लिए स्थानांतरण.
  5. 3.4 3,1 चरणों को दोहराएँ जब तक सभी आवश्यक लार्वा (इस प्रोटोकॉल में 30-40 लार्वा) एकत्र कर रहे हैं. [महत्वपूर्ण कदम: आशा 10-20% नुकसान विच्छेदन और पृथक्करण के दौरान, और योजना तदनुसार]

4. शिथिल पक्षपाती गैर विशिष्ट कोशिकाओं के हटाने: (2-3 मिनट)

[यह कदम शिथिल अनुयायी जैसे वसा शरीर और CNS गैर विशिष्ट ऊतकों के समाशोधन एड्स.]

  1. 1.6 मिलीलीटर microfuge उल्टे लार्वा cuticles युक्त ट्यूब ले लो और ताजा बर्फ के ठंडे पीबीएस के लगभग 700-800 μl साथ सतह पर तैरनेवाला जगह.
  2. पल्स - भंवर microfuge ट्यूब पूरी रफ्तार से 5 बार (नाड़ी 3 प्रति सेकंड).
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और यह 700-800 लगभग μl ताजा, ठंडा पीबीएस के साथ की जगह.
  4. 4.2 कदम और 4.3 तीन बार दोहराएँ.
  5. रेसताजा, बर्फ ठंड पीबीएस के 400 μl में लार्वा cuticles uspend

5. किसी एकल कक्ष निलंबन में अलग ऊतक: (18-20 मिनट)

[महत्वपूर्ण कदम: अधिक सेल सतह मार्कर गरीब सेल उपज और कम सेल व्यवहार्यता के लिए अग्रणी के पृथक्करण के झड़ने का कारण हो सकता है. लार्वा ऊतक या तो यांत्रिक (sonication, douncing) पृथक्करण, enzymatic पृथक्करण (trypsin, collagenase आदि) या दोनों के संयोजन के द्वारा अलग किया जा सकता है. के रूप में इन लार्वा ऊतकों को अलग कर देना कठिन हैं, हमने पाया है कि दोनों यांत्रिक और enzymatic पृथक्करण का एक संयोजन का सबसे अच्छा परिणाम सामने आए.]

  1. लार्वा पीबीएस के 400 μl में निलंबित छल्ली 1X Liberase 3 Blendzyme (28 डब्ल्यू NSCH इकाइयों / शीशी) के 1.5 μl जोड़ें.
  2. समाधान 1 अधिकतम सेटिंग (यह समाधान में छल्ली से शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को दूर करना चाहिए) पर एक दूसरे के लिए 2-3 बार भंवर.
  3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर समाधान सेते हैं. [महत्वपूर्ण कदम: ऊष्मायन समय बहुत अंतिम सेल छँटाई दक्षता को प्रभावित करता है . सिफारिश ऊष्मायन समय ऊतक ढीला करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. 15 मिनट से अधिक मत]
  4. पल्स - भंवर ट्यूब 2 पल्स प्रति सेकंड के लिए पूरी गति से अधिकतम सेटिंग्स पर 20-30 बार. यह और समाधान में मांसपेशियों और अन्य ऊतकों विज्ञप्ति चाहिए. हर कदम पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट के तहत समाधान से एक छोटा सा नमूना निरीक्षण किया. (अनुभव के साथ एक पृथक्करण के स्तर को निर्धारित करने में सक्षम एक प्रतिदीप्ति सक्षम स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सीधे microfuge ट्यूब देख द्वारा किया जाना चाहिए)
  5. लार्वा cuticles, ताजा बर्फ ठंड पीबीएस के साथ 2-3 बार धो और अंत में उन्हें ताजा, ठंडा पीबीएस युक्त 1% BSA के 500 μl में resuspend.
  6. लार्वा 2 मिलीलीटर Kontes ऊतक बनाने की मशीन और बड़े मंजूरी मूसल, पूर्व कोट ऊतक बनाने की मशीन और पीबीएस समाधान में एक 1% BSA के साथ और कुल्ला संक्षिप्त BSA समाधान त्यागने के बाद मूसल के कांच की सतह के लिए चिपके हुए छल्ली से बचने के लिए. बाद में, एक आग पॉलिश पाश्चर पिपेट का उपयोग, 5.5 कदम से cuticles BSA लेपित ऊतक चक्की को हस्तांतरण. [महत्वपूर्ण कदम: पूर्व शांत ऊतक / यह कुछ मिनट के लिए बर्फ पर रखने के कोशिका क्षति / lysis को रोकने के द्वारा चक्की मूसल].
  7. धीमी और स्थिर स्ट्रोक के साथ ऊतक Dounce frothing (लगभग 20-30 स्ट्रोक) से परहेज. [महत्वपूर्ण कदम: Dounce धीरे धीरे और लगातार, अन्यथा कोशिकाओं lyse सकता है]
  8. सेल हदबंदी के स्तर का आकलन करने के लिए, एक स्वच्छ Kimwipe ऊतक के साथ ऊतक चक्की की बाहरी दीवार मिटा, और यह एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट के तहत निरीक्षण. न्यूरॉन्स छल्ली से अलग होना चाहिए, और समाधान में देखा जा सकता है. यदि यह मुश्किल हो पाया है, वैकल्पिक रूप से समाधान का एक छोटा सा नमूना पिपेट, और यह एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट के तहत निरीक्षण. सेल पृथक्करण का एक अच्छा संकेत लार्वा छल्ली से न्यूरॉन्स के अभाव है. हालांकि, अगर एक अभी भी छल्ली के लिए संलग्न न्यूरॉन्स के अनुसार, या अधूरे dissociated कोशिकाओं के अनुसार, आगे dounce जब तक कोशिकाओं को एक एकल कक्ष निलंबन को प्राप्त करने.
  9. समाधान एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ 5 बार Triturate मानक टिप व्यास का लगभग 50% करने के लिए संकुचित, एक आग पॉलिश पाश्चर विंदुक के साथ 10 बार मानक टिप व्यास का लगभग 25% करने के लिए संकुचित द्वारा पीछा किया. [महत्वपूर्ण कदम: ताकतवर trituration कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है . मॉनिटर कदम के बीच कोशिकाओं, प्रक्रिया और तदनुसार समायोजित].
  10. एक 30 सुक्ष्ममापी सेल फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और एक 1.6 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में सेल छानना इकट्ठा. जिसके परिणामस्वरूप समाधान एक एकल कक्ष निलंबन से मिलकर बनता है और अब चुंबकीय सेल छँटाई के लिए तैयार करना चाहिए.

6. चुंबकीय मनका सेल छंटनी: (45 - 75 मिनट, एंटीबॉडी ऊष्मायन समय पर निर्भर)

  1. सेल निलंबन के 500 μl (5.10 कदम) के लिए एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों की 15 μl जोड़ें. शेष एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों बाद सेल isolations के लिए जब तक जरूरत संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. कभी कभी हाथ से मिश्रण के साथ बर्फ पर 30-60 मिनट के लिए एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. [महत्वपूर्ण कदम: एक उच्च तापमान या लंबे समय में ऊष्मायन गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन में परिणाम सकता है. ]
  3. एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र में 2 मिनट के लिए microfuge ट्यूब रखें. अनबाउंड मोतियों के साथ सभी सकारात्मक चयनित कक्षों ट्यूब के पक्ष में अलग कर देगा.
  4. धीरे धीरे सतह पर तैरनेवाला पिपेट, सेल गोली परेशान नहीं सुनिश्चित करने के.
  5. कोशिकाओं, ताजा बर्फ ठंड पीबीएस में 3-4 बार धो करने के लिए किसी भी शेष गैर विशिष्ट कोशिकाओं को हटाने.
  6. ताजा, बर्फ ठंड पीबीएस के 30 μl में कोशिकाओं Resuspend.
  7. अनुमानित शुद्धता और कक्षों की उपज के लिए, पिपेट सेल Susp के के 5 μlension hemocytometer की पॉलिश सतह पर और एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप फ्लोरोसेंट के तहत सभी दिखाई फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की गिनती. इसके अलावा गैर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं और दोष के किसी भी लक्षण के मात्रा की जाँच करें. आमतौर पर नमूना अत्यधिक फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के लिए समृद्ध हो जाएगा.

7. चुंबकीय मनका क्रमबद्ध करें कक्ष से शाही सेना अलगाव: (60 - 75 मिनट)

  1. गोली, एक चुंबकीय क्षेत्र में कोशिकाओं की गिनती करने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और PicoPure ™ आरएनए अलगाव किट (आण्विक उपकरण) से निकासी बफर के 20 μl जोड़ने. सेल संख्या पर निर्भर करता है एक निष्कर्षण बफर के एक उच्च मात्रा में जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. भंवर अधिकतम गति पर ट्यूब निष्कर्षण बफर के साथ सेल गोली के मिश्रण को सक्षम करने के लिए.
  3. 42 ° सी में 30 मिनट के लिए ट्यूब को सेते हैं.
  4. चुंबकीय मोतियों को हटाने के शाही सेना के स्तंभ शुद्धि (7.5 कदम देखें) से पहले सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूब संक्षेप में गोली से 2 मिनट चुंबकीय मोतियों के लिए +२,००० (एक्स) छ centrifuged. ट्यूब तो गोली बनाए रखने के लिए एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र में रखा है, और सतह पर तैरनेवाला एक नया microfuge ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहा है.
  5. निकालें और स्तंभ PicoPure शाही सेना निकासी किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार शाही सेना शुद्ध. DNase उपचार वैकल्पिक है, और स्तंभ पर शाही सेना शुद्धि के दौरान विश्लेषण की आवश्यकता के अनुसार निष्पादित किया जा सकता है. अंत में, उपयोग के लिए तैयार है जब तक elute बाध्य elution बफर और -80 पर दुकान ° सी की एक छोटी मात्रा (11-30 μl) में कुल शाही सेना. अगर वांछित एक μl विभाज्य 2100 Bioanalyzer (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc) पर कुल शाही सेना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

प्रतिनिधि परिणाम:

चुंबकीय मनका छँटाई ड्रोसोफिला दा न्यूरॉन्स (चित्रा 1) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन पृथक दा न्यूरॉन्स (2a चित्रा) से शुद्ध शाही सेना के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता के होने के रूप में तेज 5.8S, 18s और 28S ribosomal शाही सेना चोटियों की उपस्थिति ने संकेत दिया जब एक Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc) पर विश्लेषण पाया गया था ( चित्रा 2b). 30-40 तीसरे instar लार्वा के साथ शुरू हम औसत 300-500 वर्ग चतुर्थ दा ड्राइवर ppk GAL4 का उपयोग कर न्यूरॉन्स, और 1500-2000 दा न्यूरॉन्स (कक्षा मैं, द्वितीय, तृतीय एवं चतुर्थ) का उपयोग पर अलग करने में सक्षम थे पैन दा न्यूरॉन विशिष्ट GAL4 21-7 ड्राइवर. हमारे पृथक कक्षों की neuronal विशेष संवर्धन का आकलन करने के लिए हम मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन (QRT पीसीआर) पीसीआर दो neuronal जीन - विशिष्ट मार्करों (elav और futsch ) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया. इन विश्लेषण दोनों मार्कर दा न्यूरॉन्स के लिए एक अति विशिष्ट संवर्धन का संकेत के रूप में हमारे प्रोटोकॉल (चित्रा 3) का उपयोग कर के माध्यम से प्रवाह के लिए तुलना में जीन की महत्वपूर्ण गुना संवर्धन का पता चला. अंत में, दोनों अखिल दा न्यूरॉन्स और वर्ग-IV दा न्यूरॉन्स से अलग शाही सेना Agilent ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पूरे जीनोम oligo प्रोटीन (4 एक्स 44K) (चित्रा 4) पर transcriptional अभिव्यक्ति की रूपरेखा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ये विश्लेषण पहले से uncharacterized अणुओं और ख्यात संकेत पारगमन मार्ग है कि संभावित दा न्यूरॉन के विकास में महत्वपूर्ण कार्यात्मक भूमिका निभाने का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के अलावा दा न्यूरॉन dendrite morphogenesis के कई पहले से फंसा नियामकों की पहचान की. इन पहले से uncharacterized अणुओं के संभावित (ओं) दा न्यूरॉन के विकास, और विशेष रूप से dendrite morphogenesis mediating में भूमिका का आकलन करने के लिए डिज़ाइन अध्ययन, वर्तमान में चल रहे हैं.


चित्रा 1: ड्रोसोफिला दा न्यूरॉन्स के चुंबकीय मनका छँटाई के योजनाबद्ध (क) आयु मिलान तीसरे instar दा न्यूरॉन विशिष्ट GAL4 असर लार्वा, यूएएस - mCD8 - GFP संवाददाता transgene inverting लार्वा छल्ली अंदर बाहर बेनकाब करने के लिए द्वारा विच्छेदित कर रहे हैं हदबंदी बफर करने के लिए पीएन और ठंडा पीबीएस में संग्रहीत (ख) enzymatic पृथक्करण लार्वा छल्ली युक्त समाधान के लिए Liberase 3 Blendzyme जोड़कर किया जाता है. (ग) लार्वा ऊतकों आगे vortexing trituration, का एक संयोजन के द्वारा अलग कर रहे हैं और douncing गैर वसा शरीर पेट, और CNS (डी, ई) जैसे कोशिकाओं तो एक 30 सुक्ष्ममापी सेल फिल्टर का उपयोग फ़िल्टर्ड रहे हैं विशेष रूप से लेबल के ऊतकों को हटा दें. समाधान epithelia, मांसपेशियों, और न्यूरॉन्स सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के एक एकल कक्ष निलंबन शामिल हैं (च) विरोधी माउस CD8a एंटीबॉडी लेपित Dynabeads एम-280 सेल निलंबन को जोड़ रहे हैं, और 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर incubated . ( छ) चुंबकीय मोतियों दा न्यूरॉन्स कि एक सीडी 8 माउस GFP संलयन प्रोटीन (ज, मैं) चुंबकीय मनका लेपित कोशिकाओं एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र के समाधान में रखकर अलग कर रहे हैं टैग व्यक्त कर रहे हैं बांध. सतह पर तैरनेवाला त्याग है, और कोशिकाओं को तीन बार धो रहे हैं किसी भी अवशिष्ट गैर विशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए, घंटे (ञ ) में जिसके परिणामस्वरूपighly दा न्यूरॉन्स की आबादी शुद्ध. कृपया यहाँ क्लिक करें संख्या 1 के एक बड़ा संस्करण देख.


चित्रा 2: (क) सकारात्मक चयनित, GFP फ्लोरोसेंट वर्ग चतुर्थ दा सेल हदबंदी और चुंबकीय मनका छँटाई द्वारा पृथक न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि छवि. न्यूरॉन्स के परिणामस्वरूप जनसंख्या को अत्यधिक कम या कोई contaminating सेल दोष के साथ वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध होना निर्धारित किया गया था (ख) एक Agilent के कुल शाही सेना की 2100 Bioanalyzer electropherogram (Agilent टेक्नोलॉजीज, Inc) चुंबकीय मनका सॉर्ट किया गया दा न्यूरॉन्स से अलग है. एक उत्कृष्ट कुल शाही सेना के रूप में 5.8S, 18s, और 28S rRNAs की उपस्थिति द्वारा संकेत गुणवत्ता दिखा. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.


चित्रा 3: QRT-पीसीआर पृथक दा (GAL421-7, यूएएस - mCD8 - GFP) न्यूरॉन्स और अंश के माध्यम से प्रवाह तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया था में neuronal मार्कर जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण. दो neuronal विशिष्ट मार्कर जीन (elav और futsch) की अभिव्यक्ति के स्तर QRT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया. इन विश्लेषण से प्राप्त मान अंतर्जात नियंत्रण (rp49) के लिए सामान्यीकृत थे, और अंश के माध्यम से प्रवाह में मनाया उन लोगों के सापेक्ष स्तर ΔΔCτ 6 पद्धति का उपयोग करके गणना की गई. दोनों elav और futsch पृथक दा न्यूरॉन जनसंख्या में काफी समृद्ध थे अंश के माध्यम से प्रवाह के रूप में की तुलना में.


चित्रा 4: प्रतिनिधि वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन विशिष्ट माइक्रोएरे छवि फ़ाइल लेबल Cy3. यहाँ दिखाया है एक Agilent ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पूरे जीनोम oligo (4 एक्स 44K) माइक्रोएरे Cy3 - labeld कुल वर्ग चतुर्थ दा चुंबकीय मनका छँटाई के द्वारा शुद्ध न्यूरॉन्स से अलग शाही सेना के साथ संकरित. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 4 का एक बड़ा संस्करण देख.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल और परिधीय न्यूरॉन्स जो ड्रोसोफिला तृतीय instar लार्वा एक चुंबकीय मनका सेल छँटाई की रणनीति का उपयोग छल्ली की भीतरी सतह को कस पालन करने के अलगाव और शुद्धि के लिए अनुकूलित है. जब तक हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है विशेष रूप से अन्य कोशिका प्रकार है कि लार्वा या विकास के pupal चरणों में छल्ली का पालन के अलगाव के लिए ड्रोसोफिला दा इस प्रोटोकॉल के न्यूरॉन्स अनुप्रयोगों को अलग (जैसे epithelia, मांसपेशियों, अन्य परिधीय न्यूरॉन्स) के द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है है कुछ मापदंडों अलग और GAL4 अलग उपयोग यूएएस - mCD8 GFP संवाददाता transgenes जो ब्याज की कोशिका प्रकार या प्रकार का लेबल . इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल दोनों नुकसान के समारोह और लाभ के समारोह दृष्टिकोण जहां एक transgene यूएएस mCD8 - GFP कि एक GAL4 transgene के साथ युग्मित किया जा सकता है या तो प्रत्यक्ष में ब्याज की एक जीन क्लोन किया जा सकता है में इस्तेमाल किया जा सकता है जीन विशिष्ट नुकसान के समारोह (जैसे यूएएस आरएनएआई) या ब्याज की एक सेल प्रकार के लाभ के समारोह. उदाहरण के लिए, एक प्रतिलेखन कारक के मामले में एक नुकसान फ़ंक्शन या लाभ के समारोह एक सेल प्रकार में ब्याज की अभिव्यक्ति पर संभावित ऊपर या नीचे विनियमित जीन की पहचान की इच्छा हो सकती है. इस प्रोटोकॉल के माध्यम से ब्याज की शुद्ध सेल प्रकार से कुल शाही सेना और अलग इस शाही सेना का उपयोग करने के लिए माइक्रोएरे अभिव्यक्ति की रूपरेखा प्रदर्शन करके यह संभव है कि विभिन्न विनियमित जीन की पहचान है कि transcriptional विनियमन के बहाव के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व हो सकता है कि कक्ष के भीतर प्ररूपी परिवर्तन mediating में एक भूमिका निभा .

सफल सेल छँटाई के लिए यह आवश्यक है करने के लिए महत्वपूर्ण कदम ऊपर प्रोटोकॉल में प्रकाश डाला करने के लिए सावधान ध्यान दे. आम समस्या क्षेत्रों है कि कुछ और समस्या निवारण और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है के उदाहरण, सेल प्रकार पर निर्भर करता है, (1) कम सेल उपज और (2) चुंबकीय मनका अलगाव के दौरान clumping सेल शामिल हैं. पहले मामले में, एक Liberase Blendzyme तीन की एकाग्रता को कम करने की कोशिश करो, और douncing के माध्यम से यांत्रिक हदबंदी बढ़ाने के द्वारा क्षतिपूर्ति. दूसरे मामले में, एक चुंबक पर चिपकने वाला प्रयोगशाला टेप के एक एक या कई परतों को लागू करने के द्वारा चुंबकीय क्षेत्र की ताकत को कम करने की कोशिश कर सकते हैं.

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Acknowledgments

हम डीआरएस धन्यवाद. Yuh-Nung जनवरी और मक्खी इस अध्ययन में इस्तेमाल शेयरों प्रदान करने के लिए वेस Grueber. लेखक थॉमस एफ और केट मिलर इस शोध के समर्थन के लिए Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट (DNC) और जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय के प्रोवोस्ट के कार्यालय (EPRI) को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) MP Biomedicals PBS10X02 Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3 Roche Group 11814176001 Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY Sigma-Aldrich 83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody Invitrogen MCD0815 100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V GIBCO, by Life Technologies 11018-017 Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 11205D 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions

Equipment

  • (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used.
  • Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002)
  • Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407)
  • 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004)
  • Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20)
  • Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08)
  • Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips
  • Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity
  • Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration
  • Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g)
  • Vortex
  • Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  4. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
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  6. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).

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  1. Hi, I am very interested in getting more info aboout magnetic beads for separating potrein A, and info about how to scale and validate processes. Please if you know any place where I can get this info please tell me. The only valuable think I have found 'till now is this free guide, not very deep deep though, about http://sepmag.eu/the-basic-guide-to-use-biomagnetic-separation-in-production-processes-free-download magnetic bead separation production processes

    Reply
    Posted by: Paula C.
    March 24, 2013 - 1:37 PM
  2. Hi Paula, I'm Lluis M. Martinez, CSO from Sepmag. Thanks for share the guide link. This guide is 'basic' as you point. The 'advanced' version (also free) would be ready in few weeks, if you have download the 'basic' you would receive and e-mail when it would be ready. We have also published the 'Starting guide to Validate Biomagnetic Separation Processes' a http://sepmag.eu/the-starting-guide-to-validate-biomagnetic-separation-processes/. The 'advanced' guide on the subjet guide is also offered free to who download the 'starting' one. We are tryng to share our experience with solving issues magnetic beads-based IVD manufacturing processes (some of our systems are working with 10 litres batches). Please feel free to contact me through the sepmag website contact form and I may provide some specfic references for your questions.

    Reply
    Posted by: Lluis M. M.
    March 25, 2013 - 10:49 PM
  3. Thank you very much Lluis, this guide has been very helpful.

    Reply
    Posted by: Paula C.
    March 28, 2013 - 2:40 PM

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