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मानव pluripotent स्टेम सेल के Immunocytochemical विश्लेषण एक सेल्फ मेड Cytospin उपकरण का उपयोग कर

Biology

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Summary

सस्पेंशन मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के immunocytochemical धुंधला (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) सेल सतह मार्कर के लिए एक स्वयं बनाया cytospin प्रेक्षण और मात्रा का ठहराव के लिए कक्षों की एक monolayer बनाने तंत्र का उपयोग के आधार पर हासिल की थी.

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Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).

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Abstract

मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) है कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) शामिल रोमांचक उनके असीम आत्म नवीकरण क्षमता और उनके कई प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के कारण सेल स्रोत हैं. hPSCs के pluripotent राज्य आमतौर पर qPCR, immunocytochemistry जैसे तकनीकों द्वारा मूल्यांकन किया है, और अन्य द्वारा

Protocol

भाग 1: सस्पेंशन Immunocytochemical धुंधला

  1. कक्ष एक एकल कक्ष निलंबन में harvested रहे हैं.
  2. कोशिकाओं तो 1.5 2ml microcentrifuge ट्यूबों में स्थानांतरित कर रहे हैं और 4 मिनट के लिए 200g पर centrifuged.
  3. कक्ष से बाहर सतह पर तैरनेवाला aspirating से धो रहे हैं, PBS की 1ml में फिर से निलंबित - + (2 मिलीग्राम के बिना और Ca + 2) और फिर 200g पर फिर से 4 मिनट के लिए centrifuged. यह दो बार किया जाना चाहिए.
  4. धोने के बाद, कोशिकाओं तो 1ml 4% कमरे के तापमान पर (पीएफए) के 10 मिनट के लिए paraformaldehyde में फिर से उन्हें निलंबित द्वारा तय की.
  5. कक्ष फिर से धो रहे हैं दो बार पीबीएस के 1ml के साथ -.
  6. धोने, द्वारा ब्लॉक कोशिकाओं के बाद फिर से निलंबित उन्हें ब्लॉक समाधान के 1ml (6% serum/94% पीबीएस -) में. कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इन सेते हैं.
  7. के बाद, 200g में 4 मिनट के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र बाहर ब्लॉक समाधान aspirate. 1ml प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (सिफारिश कमजोर पड़ने पर ब्लॉक समाधान के साथ किए गए) में कोशिकाओं पुनः निलंबित. कक्ष या तो 1 घंटे के लिए या 4 बजे ° सी रातोंरात अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान पर incubated हो सकता है.
  8. कोशिकाओं तो ब्लॉक समाधान के 1ml के साथ दो बार धोया.
  9. बाद माध्यमिक एंटीबॉडी (सिफारिश कमजोर पड़ने पर ब्लॉक समाधान के साथ किए गए) समाधान और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते 1ml में फिर से निलंबित कोशिकाओं.
  10. 1 घंटे के बाद, कोशिकाओं तो फिर धोया जाना चाहिए ब्लॉक समाधान के 1ml के साथ दो बार.
  11. - ब्लॉक समाधान के साथ धोने के बाद, कोशिकाओं को फिर से पीबीएस के 1ml के साथ धो.
  12. विभिन्न washes के बाद, की 1ml में कोशिकाओं का फिर से निलंबित परमाणु DAPI (पीबीएस में DAPI के कमजोर पड़ने 1:10,000 -) दाग और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  13. 5 मिनट के बाद, 200g में 4 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र. - DAPI परमाणु दाग ​​समाधान और पीबीएस के 1ml में फिर से निलंबित कोशिकाओं Aspirate.

भाग 2: hPSCs cytospin तंत्र के माध्यम से उत्पन्न स्लाइड्स में निगमन

  1. प्लास्टिक स्लाइड एक ड्रिल प्रेस के साथ उन में छेद के वांछित राशि बनाने के द्वारा तैयार हैं. व्यास micropipette टिप (ओं) के व्यापक व्यास के लिए इस्तेमाल किया जा तुलना में सबसे अधिक 1mm बड़ा होने की जरूरत है.
  2. फिल्टर पेपर कैंची के साथ प्लास्टिक स्लाइड के मापदंडों को काट रहा है.
  3. छेद तो फिल्टर पेपर में बना रहे हैं. छेद के आकार (ओं) काफी बड़ी है कि micropipette टिप (ओं) के माध्यम से यह snuggly फिट बैठता है होना चाहिए.
  4. के बाद, एक तैयार प्लास्टिक स्लाइड्स के शीर्ष पर रखा और एक गिलास में स्लाइड कट फिल्टर पेपर (चित्रा 1) के नीचे रखा है. परतों टेप के साथ सुरक्षित कर रहे हैं.
  5. 100μL का एक भाग 1 से सना हुआ सेल निलंबन की अधिकतम (वांछित monolayer घनत्व पर निर्भर करता है) तो micropipette टिप (ओं) के शीर्ष में रखा गया है.
  6. यदि आवश्यक हो, तो सेल के समाधान के साथ तंत्र और तौला जा सकता है इसी तरह के वजन के एक काउंटर संतुलन बनाया.
  7. cytospin तंत्र और काउंटर संतुलन तो एक डेस्कटॉप अपकेंद्रित्र में रखा जा सकता है और 4 मिनट के लिए 200g पर centrifuged.
  8. Centrifugation के बाद, cytospin तंत्र ध्यान से एक तरीका है कि गिलास स्लाइड से कोशिकाओं को बेदखल में नहीं में disassembled है.
  9. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त आसपास पीबीएस - कांच पक्ष पर बाहर से aspirated.
  10. कोशिकाओं तो एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के लिए जाँच अगर वांछित सेल monolayer हासिल किया गया है देखा जा सकता है है.

भाग 3: बढ़ते स्लाइड्स

  1. वांछित बढ़ते मीडिया की एक बूंद सीधे प्रत्येक क्षेत्र युक्त कोशिकाओं के केंद्र में रखा गया है.
  2. के बाद, एक कवर पर्ची धीरे हवाई बुलबुले से बचने के यदि संभव हो तो कोशिश कर रहा स्लाइड्स पर उतारा है.
  3. अतिरिक्त बढ़ते मीडिया तो स्लाइड्स से निकाल दिया जाता है.
  4. के बाद, कवर फिसल जाता है के पक्ष नाखून वार्निश के साथ सील कर रहे हैं.
  5. स्लाइड एक अंधेरे भंडारण क्षेत्र में रखा जा सकता है है जब तक परिणाम मनाया और प्रलेखित रहे हैं.

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Discussion

हमारी प्रयोगशाला के प्रयोजनों के लिए, माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) पर हो स्टेम सेल संस्कृतियों की एक 35 मिमी पकवान cytospin तंत्र के साथ उपयोग के लिए immunocytochemical धुंधला प्रक्रिया के लिए आवंटित किया है. कोशिकाओं तो passaging एंजाइमी के माध्यम से एकत्र कर रहे हैं, जितना संभव के रूप में MEF परत के हटाने एक एकल कक्ष निलंबन में. यदि MEF परत से अधिक प्रभावी स्टेम सेल अलगाव वांछित है, कालोनियों मैन्युअल तो उठाया जा सकता है निलंबन में पचता. यदि फीडर मुफ्त शर्तों स्टेम कोशिकाओं संस्कृतियों बढ़ रही में इस्तेमाल कर रहे हैं, कालोनियों बस बंद scraped किया जा सकता है और निलंबन में पचता. जबकि एक प्रारंभिक एकल कक्ष निलंबन आदर्श है, किसी भी सेलुलर clumps को प्रभावी ढंग से कई धोने और फिर निलंबन कदम immunocytochemical धुंधला हो जाना प्रक्रिया में के लिए बुलाया भर में अलग होना चाहिए तोड़ा जा.

वीडियो धुंधला hPSCs के लिए कोशिकी मार्करों के उपयोग पर ध्यान केंद्रित. यदि hPSCs के intracellular धुंधला वांछित है, जिसमें कोशिकाओं 1ml Permeabilization समाधान के में धो रहे हैं किया जाना (50mLs 25μL 20 के बीच के साथ उच्च नमक बफर) तीन बार पहले ब्लॉक समाधान के अलावा एक अतिरिक्त कदम (1.6 चरण) की जरूरत है पहले पुनः निलंबित उन्हें ब्लॉक समाधान में. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु है कि उल्लेख किया जाना चाहिए है कि प्रक्रिया में 1.9 कदम से, देखभाल नमूने के प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति विरंजन और DAPI परमाणु दाग ​​को रोकने में ले लिया होना चाहिए.

कई धोने और प्रक्रिया में फिर से निलंबन कदम बीतने तैयार स्टेम सेल कालोनियों, 400K-600K कोशिकाओं के आसपास का अनुमान का एक अच्छा राशि के साथ एक पूरे 35 मिमी पकवान की वजह से पच होने की सिफारिश की है और प्रारंभिक निलंबन में इस्तेमाल किया . यह कुछ सेल प्रक्रिया की प्रकृति के कारण नुकसान की प्रत्याशा में किया जाता है. सैद्धांतिक रूप से, कक्षों की एक बहुत छोटी राशि प्रारंभिक निलंबन में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन देखभाल के एक अतिरिक्त राशि के क्रम में आगे सेल नुकसान को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए. जब immunocytochemical धुंधला प्रक्रिया के बाद cytospin तंत्र पर लोड हो रहा है, 10k-50k के एक सेल घनत्व आदर्श है. यह उल्लेखनीय है कि, जबकि 100μL अधिकतम राशि है कि एक cytopsin तंत्र है कि एक 0.1μL 10μL micropipette टिप का उपयोग करता है पर लोड किया जा सकता है, एक छोटे () के आसपास में 20μL की - 30μL राशि है चाहिए युक्त आदर्श सेल घनत्व की सिफारिश की है. यह तरल के गिलास स्लाइड पर अनावश्यक अतिप्रवाह minimizes. अंत में, जब अपकेंद्रित्र के साथ cytospin तंत्र का उपयोग कर के रूप में लंबे समय के रूप में तंत्र पार्श्व आंदोलन, अपकेंद्रित्र द्वारा बनाया जबकि चल रहा है हमारे ज्ञान करने के लिए, बल, flipping या से गिरने से तंत्र को ध्यान में रखते हुए पर्याप्त से सुरक्षित है.

Immunocytochemical प्रक्रिया में प्रयोग किया जाता के समाधान के लिए सामग्री:

  1. 2% (पीएफए) Paraformaldehyde / 2% Sucrose
    1. गर्म हलचल प्लेट पर 56 से 75 मिलीलीटर आसुत पानी और जगह जोड़ें डिग्री सेल्सियस
    2. 2 जी पीएफए ​​वजन, और कांच बीकर में जोड़ें.
    3. 2 जी sucrose के वजन, और कांच बीकर में पीएफए ​​को जोड़ने.
    4. 1M सोडियम हीड्राकसीड के 2 बूँदें जोड़ें.
    5. एक बार सभी अभिकर्मकों समाधान में चले गए हैं, 10X पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ने + +.
    6. 7.2-7.4 के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें.
    7. आसुत जल के साथ 100 मिलीलीटर मात्रा को लाओ.
      4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस, और 1 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें. Aliquots @ -20 डिग्री सेल्सियस 1 महीने के लिए संग्रहीत कर सकते हैं. किसी भी वेग को निकालने के विगलन के बाद संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
  2. ब्लॉक समाधान (10ml)
    1. 9.4 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें -.
    2. पीबीएस के लिए 0.6 मिलीलीटर सीरम जोड़ें -. (यह प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है.)
      4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के भीतर का उपयोग.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के लिए आंशिक वित्त पोषण 0744556 NSF कैरियर (राव) और VCU HHMI विज्ञान शिक्षा और अनुसंधान कार्यक्रम (Pascual) के माध्यम से एक छात्रवृत्ति के द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide Thermo Fisher Scientific, Inc. 117437 Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
0.1-10μL Filter Tips USA Scientific, Inc. 1121-3810
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 120542-B
Cytoseal 280 Richard-Allan Scientific 8311-4 Mounting Medium
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Normal Goat Serum Invitrogen 10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4304 Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4303 Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A11029 Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG Invitrogen A11006 Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride Calbiochem 268298

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References

  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

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