Author Produced

Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

وقد تحقق تلطيخ تعليق immunocytochemical البشرية الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) عن سطح الخلية علامات (SSEA-3/SSEA-4) على أساس استخدام جهاز cytospin عصامي لإنشاء أحادي الطبقة من الخلايا للمراقبة والقياس الكمي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pascual, E. Y., Riggs, M. J., Rao, R. R. Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus. J. Vis. Exp. (38), e1944, doi:10.3791/1944 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) هي مصادر الخلية مثيرة نظرا لقدراتها الذاتية التجديد لا حدود لها وقدرتها على التمايز إلى أنواع خلايا متعددة. عادة ما يتم تقييم حالة المحفزة للhPSCs بواسطة تقنيات مثل qPCR ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، وغيرها

Protocol

الجزء 1 : يلطخ تعليق Immunocytochemical

  1. ويتم حصاد الخلايا في خلية واحدة تعليق.
  2. ثم يتم نقل الخلايا في أنابيب microcentrifuge 1.5 2mL وطرد في 200G لمدة 4 دقائق.
  3. تغسل الخلايا التي طاف بها الشفط ، وإعادة معلقة في 1mL من برنامج تلفزيوني -- (بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 +) ثم طرد مرة أخرى في 200G لمدة 4 دقائق. وينبغي أن يتم ذلك مرتين.
  4. بعد غسلها ، ثم يتم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في بارافورمالدهيد ٪ 1mL من 4 (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  5. يتم غسلها مرتين مع الخلايا مرة أخرى 1mL من برنامج تلفزيوني --
  6. بعد غسل كتلة الخلايا ، من خلال إعادة تعليقها في 1mL من الحل بلوك (6 ٪ serum/94 PBS ٪ --). احتضان هذه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  7. بعد ذلك ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق ، ونضح من الحل بلوك. اعادة تعليق الخلايا في 1mL الضد من الحل الأساسي (كتلة مصنوعة من الحل في التخفيف مستحسن). يمكن أن تكون إما خلايا حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو على 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الشروع في الخطوة التالية.
  8. ثم يتم غسلها مرتين مع الخلايا 1mL من الحل بلوك.
  9. بعد ذلك اعادة تعليق الخلايا في جسم 1mL حل الثانوية (مصنوعة من كتلة الحل في التخفيف الموصى بها) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  10. بعد 1 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا ثم غسلها مرة أخرى مرتين مع 1mL من الحل بلوك.
  11. بعد غسله بمحلول بلوك ، يغسل خلايا مرة أخرى مع 1mL من برنامج تلفزيوني --
  12. بعد يغسل المختلفة ، وإعادة تعليق من الخلايا في 1mL دابي النووية وصمة عار (1:10،000 تخفيف دابي في برنامج تلفزيوني --) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  13. بعد 5 دقائق ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق. نضح بها النووية دابي حل صمة عار والخلايا في اعادة تعليق 1mL من برنامج تلفزيوني --

الجزء 2 : إدراج hPSCs في الشرائح التي تتولد من خلال جهاز cytospin

  1. وتعد الشرائح البلاستيكية بجعل المبلغ المطلوب من الثقوب فيها مع الصحافة الحفر. القطر يجب أن يكون أكبر في معظم 1MM من أوسع قطرها غيض micropipette (ق) ليتم استخدامها.
  2. يتم قطع الورق لتصفية المعلمات الشريحة من البلاستيك مع المقص.
  3. ثم يتم إجراء ثقوب في ورقة الترشيح. ينبغي أن حجم الثقب (ق) أن تكون كبيرة بما يكفي التلميح micropipette (ق) يناسب سنججلي من خلال ذلك.
  4. بعد ذلك ، وضعت واحدة من الشرائح البلاستيكية أعدت على أعلى شريحة زجاجية وضعت في أسفل ورقة تصفية قطع (الشكل 1). يتم تأمين طبقات مع الشريط.
  5. ثم يتم وضع كحد أقصى 100μL (اعتمادا على الكثافة أحادي الطبقة المطلوب) لتعليق الخلية الملون من الجزء 1 الى الجزء العلوي من طرف micropipette (ق).
  6. إذا لزم الأمر ، يمكن أن وزن الجهاز مع حل الخلية ، وخلق توازن مضاد لوزن مماثل.
  7. ويمكن للجهاز cytospin ومكافحة ميزان ثم توضع في جهاز الطرد المركزي في سطح المكتب وطرد 200G لمدة 4 دقائق.
  8. بعد الطرد المركزي ، يتم تفكيكها بعناية جهاز cytospin بطريقة أن لا إزاحة الخلايا من شريحة زجاجية.
  9. إذا ، من الضروري زيادة PBS المحيطة بها -- على الجانب الزجاجي في يستنشق بها.
  10. ويمكن عندئذ أن ينظر الخلايا باستخدام مجهر مضان للتحقق مما إذا تم تحقيق المونولاير الخلية المطلوبة.

الجزء 3 : تركيب الشرائح

  1. يتم وضع قطرة من وسائل الإعلام المطلوب تركيب مباشرة في مركز كل منطقة تحتوي على الخلايا.
  2. بعد ذلك يتم خفض بلطف زلة تغطية على الشرائح في محاولة لتجنب فقاعات الهواء إذا أمكن ذلك.
  3. ثم تتم إزالة الزائدة وسائل الاعلام متزايدة من الشرائح.
  4. بعد ذلك يتم اغلاق الجانبين من زلات مع تغطية طلاء الأظافر.
  5. يمكن الاحتفاظ الشرائح في منطقة مظلمة حتى يتم تخزين النتائج لوحظ وتوثيقها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لأغراض مختبرنا ، يتم تخصيص طبق 35mm الثقافات الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في الخلايا الليفية الماوس (MEFs) لإجراء تلطيخ immunocytochemical للاستخدام مع جهاز cytospin. ثم يتم جمع الخلايا من خلال الركض الأنزيمية ، وإزالة أكبر قدر من طبقة MEF ممكن ، في تعليق وحيد الخلية. إذا كان المطلوب أكثر من الخلايا الجذعية فعالة بمعزل عن طبقة MEF ، يمكن المستعمرات التقطت يدويا ثم هضمها في التعليق. إذا استخدمت ظروف التغذية الحرة في زراعة الخلايا الجذعية الثقافات ، يمكن ببساطة أن المستعمرات كشطت وهضمها في التعليق. بينما أولية وحيدة الخلية تعليق مثالي ، ينبغي بفعالية أي كتل الخلوية يمكن كسرها بعيدا في أنحاء عديدة الغسيل وإعادة تعليق الخطوات المطلوبة في هذا الإجراء تلطيخ immunocytochemical.

ركز الفيديو على استخدام علامات خارج الخلية لhPSCs تلطيخ. إذا كان المطلوب من الخلايا تلطيخ hPSCs ، خطوة إضافية قبل إضافة محلول بلوك (الخطوة 1.6) يجب القيام به حيث يتم غسل الخلايا في محلول من 1mL Permeabilization (50mLs العازلة من الملح مع 25μL من توين 20) ثلاث مرات قبل إعادة تعليقها في الحل بلوك. نقطة أخرى الحرجة التي ينبغي ذكرها هي أن من الخطوة 1.9 في الإجراء ، ينبغي توخي الحذر في التقليل من التعرض للضوء على عينات لمنع تبييض مضان من الأجسام المضادة الثانوية وصمة عار دابي النووية.

بسبب العديد من غسل وإعادة تعليق الخطوات في هذا الإجراء ، طبق كامل 35mm مع كمية لا بأس بها من جاهزة للمرور مستعمرات الخلايا الجذعية ، تشير التقديرات إلى أن حوالي 400K - 600K الخلايا ، فمن المستحسن أن يتم هضمها واستخدامها في التعليق الأولي . يتم ذلك تحسبا لفقدان بعض الخلايا نتيجة لطبيعة هذا الاجراء. نظريا ، يمكن استخدام كمية أقل بكثير من الخلايا في التعليق الأولي ولكن يجب أن تؤخذ كمية اضافية من الرعاية من أجل تقليل خسارة المزيد من الخلايا. عند تحميلها على جهاز cytospin بعد العملية تلطيخ immunocytochemical ، كثافة الخلية 50K - 10K هو المثل الاعلى. وتجدر الإشارة إلى أنه ، في حين 100μL هو المبلغ الأقصى الذي يمكن تحميله على جهاز يستخدم cytopsin 0.1μL غيض micropipette 10μL ، وهي كمية أقل (حوالي 20μL -- 30μL) التي تحتوي على كثافة الخلية المثالي هو الموصى بها. هذا يقلل من السائل الفائض لا لزوم لها على الشريحة الزجاجية. أخيرا ، عند استخدام أجهزة الطرد المركزي مع cytospin ، طالما أن الجهاز هو في مأمن من الحركة الجانبية ، وقوة الطرد المركزي التي أنشأتها أثناء تشغيل و، على حد علمنا ، لم تكن كافية في الحفاظ على الجهاز من التقليب أو السقوط.

المكونات اللازمة لحلول المستخدمة في إجراء immunocytochemical :

  1. 2 ٪ لامتصاص العرق (PFA) / السكروز 2 ٪
    1. إضافة 75 مل من الماء المقطر ، ووضع على لوحة اثارة ساخنة عند 56 درجة مئوية.
    2. خارج تزن 2 غرام PFA ، وإضافة إلى الدورق الزجاجي.
    3. خارج تزن 2 غرام السكروز ، وإضافة إلى منهاج العمل في الدورق الزجاجي.
    4. إضافة 2 قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 1M.
    5. مرة واحدة كل الكواشف قد ذهب إلى حل ، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 10X + +.
    6. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل ل7،2-7،4.
    7. لإظهار حجم 100 مل من الماء المقطر.
      المحل في 4 درجات مئوية ، واستخدم في حدود 1 في الاسبوع. ويمكن تخزين Aliquots @ -20 درجة مئوية لمدة شهر 1. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة بعد ذوبان لإزالة أي راسب.
  2. كتلة محلول (10ML)
    1. إضافة 9.4 مل PBS --.
    2. إضافة 0.6 مل من الدم إلى برنامج تلفزيوني -- (وهذا قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة).
      المحل في 4 درجات مئوية ، واستخدم في غضون 48 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم توفير التمويل الجزئي لهذا العمل من قبل قوات الامن الوطني وظائف 0744556 (راو) وعلى منحة دراسية من خلال تعليم العلوم ، جامعة فرجينيا كومنولث HHMI وبرنامج البحث (باسكوال).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide Thermo Fisher Scientific, Inc. 117437 Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned Fisher Scientific 12-550-15
0.1-10μL Filter Tips USA Scientific, Inc. 1121-3810
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 120542-B
Cytoseal 280 Richard-Allan Scientific 8311-4 Mounting Medium
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
Normal Goat Serum Invitrogen 10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4304 Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody EMD Millipore MAB4303 Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen A11029 Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG Invitrogen A11006 Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride Calbiochem 268298

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
  2. Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics