עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Biology
 

Summary

איברים עובריים מוקדמים תרבות ריאות היא מערכת שימושית מאוד ללמוד אפיתל-mesenchymal אינטראקציות. המורפוגנזה ההכנסות הן אפיתל mesenchymal בתנאים מסוימים, כי ניתן להשפיע בקלות במערכת זו.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מפרט ריאות בראשיתי כמו גם המורפוגנזה הסתעפות ויצירת שושלות תאים שונים ריאתי דורש אינטראקציה ספציפית של האנדודרם הריאה עם mesenchyme המקיפים שלה mesothelium. ריאות mesenchyme הוכח להיות מקור של אותות אינדוקטיבי עבור המורפוגנזה ריאות הסתעפות. אפיתל-mesenchymal-mesothelial אינטראקציות גם קריטי המורפוגנזה ריאות העובר. איברים עובריים מוקדמים תרבות ריאות היא מערכת שימושית מאוד ללמוד אפיתל-mesenchymal אינטראקציות. המורפוגנזה ההכנסות הן אפיתל mesenchymal בתנאים מסוימים, כי ניתן להשפיע בקלות במערכת זו (בהיעדר השפעה אימהית זרימת הדם). וחשוב יותר טכניקה זו ניתן לעשות זאת בקלות, התקשורת serumless תרבות הגדרה כימית. רווח והפסד של פונקציה יכולה להיות מושגת באמצעות חלבונים לידי ביטוי, וקטורים ויראליים רקומביננטי ו / או ניתוח של זנים עכבר מהונדס, antisense RNA, כמו גם גנים RNA מציאה הפרעה.

Protocol

תרבות איברים היא טכניקה שימושית מאוד תכליתי ללמוד גנים ביטוי חלבון. תרבות שיטות אלה לשעבר vivo יכול לשמש ראשוני או משלים במחקרים vivo.

1. ריאות עובריים בידוד

  1. מתוזמן בהריון עכברים מוקרבים ביום postcoitum 11.5 או 12.5 (E11.5 12.5-) על ידי ה-CO 2 הרדמה על פי הנחיות NIH ו OLAW. חיה ממוקם בתא ו CO 2 100% הוא הציג. לאחר שהחיה היא מודעת זרימת CO 2 הוא גדל. מוות קליני של החיה יש להבטיח.
  2. כל השלבים הבאים צריך להסתיים בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית. הרחם יוסר הנקבות בהריון. כדי להסיר את הרחם מן החיה, הנקבות בהריון ממוקמות על גבם רוססו עם אתנול 70%. מבצעים חתך באזור הבטן, העור הוסר על ידי משיכת העור כלפי מעלה תוך כדי החזקת הרגליים האחוריות של החיה. חלל הצפק נפתח הרחם יוסר החיה.
  3. דם היא שטפה ידי הנחת הרחם צינור חרוטי 50 מ"ל מלאים פתרון הנקס מלח קר מאוזן (HBSS), ואת הצינור הוא התנדנד בעדינות במשך 2 דקות.
  4. הרחם ממוקם מכן תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאוסקופית בצלחת פטרי, ואת העוברים שוחרר מן הרחם על ידי חריטה לדופן הרחם באמצעות מספריים האביב. עוברים נקצרים בעזרת כף מחוררת, והניחו על קרח בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS.
  5. תחת המיקרוסקופ לנתח סטריאוסקופית, הריאות עובריים הם גזור אחד אחד בצלחת פטרי המכילות HBSS קר (איור 1).
  6. ריאה עובריים מבודדים מושם על קרח בצלחת פטרי המכילות HBSS בעזרת פיפטה העברת סטרילית.

2. ריאות עובריים תרבות

  1. 500 מיקרוליטר ל למיליליטר 1 לכל היטב D-MEM/F-12 בתוספת 50 יחידות / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, פניצילין הוא הוסיף בצלחת פוליסטירן Nunclon.
  2. פוליקרבונט Nuclepore Track-Etch ממברנה ממוקם על גבי התקשורת. כאשר פוליקרבונט Nuclepore Track-Etch ממברנה ממוקם על גבי התקשורת, לוודא כי הצד המבריק הוא כלפי התקשורת, הצד המחוספס פונה מעלה.
  3. ריאות העובר גזור ממוקמת על גבי ממברנה פוליקרבונט מסלול Etch Nuclepore באמצעות פיפטה העברת סטרילית.
  4. עמדת ריאות העוברית מותאם באמצעות מלקחיים. ריאה עובריים שהונחו על המסנן צריך קנה הנשימה שלם להציב קנה הנשימה שלהם עם בעל עמדה ישר, ובכך מאפשר לריאות כל יש את הלחץ הפנימי זהה.
  5. המנה פוליסטירן Nunclon מועבר בפעם תרבות הרצוי חממה תא (איור 2).

3. חומרים

1. עובריים ריאות שלמות בידוד

  1. מתוזמן בהריון (C57BL6 סוג בר או מהונדס) עכברים להיות הקריב ביום postcoitum 11.5-13.5 (E11.5-13.5).
  2. הנקס "פתרון מאוזן מלח (HBSS) (1X), נוזלי, ללא כלור, סידן, מגנזיום כלוריד, או מגנזיום סולפט. (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת 50 יחידות / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, פניצילין (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). חנות HBSS בטמפרטורת החדר ב 4 ° C לאחר הפתיחה. Aliquot ולאחסן את הפניצילין, סטרפטומיצין ב -20 ° C.
  3. מיקרוסקופ לנתח סטריאוסקופית (לייקה, Wetzlar, גרמניה).
  4. Dissection כלים כולל דומון מלקחיים, מספריים איריס פיין (ישר), נויס באביב מספריים מוריה ® כפית (מחורר) (כלי מדעי בסדר, פוסטר סיטי, קליפורניה).

2. עובריים ריאות שלמות תרבות

  1. השתנה Dulbecco הנשר בינונית: מערבבים מזין F-12 (D-MEM/F-12) (1X), נוזל, 01:01 מכיל L-גלוטמין, אבל שום חיץ HEPES. (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת 50 יחידות / מ"ל ​​של סטרפטומיצין, פניצילין (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). שמור את הבקבוק DMEM/F-12 מן האור (למשל על ידי מכוסה בנייר אלומיניום) ולאחסן ב 4 ° C. Aliquot ולאחסן את הפניצילין, סטרפטומיצין ב -20 ° C.
  2. Nuclepore פוליקרבונט Track-Etch ממברנה, 8.0-מ ', 13 מ"מ (Whatman Nuclepore Track-Etch קרום (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Nunclon צלחת פוליסטירן עם מכסים, 4 בארות (רוצ'סטר, ניו יורק).
  4. Pipettes העברת פנויה, סטרילי (פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה).

איור 1
באיור 1. Dissection של E12 הריאות עובריים. (א) E12.5 העובר כולו במבט מהצד הנכון. (ב) forelimb ימין הוסר העובר. (C) מלקחיים המוחזקות על ידי יד שמאל מחזיקה את העובר קבוע בצלחת. החצים מצביעים על תוכנית של דיסקציה (ד ') ריאות עובריים טמונה האחורי ללב (מוסר) ו הקדמי לעמוד השדרה. נתון זה מראה את הריאות לאחר הסרת העור לב. (ה) הסרת הלוע מאפשרת הפרדה של הריאה שלמים מן העובר. (ו) רקמת הלוע והוושט חיצוניים ואת כבר גזוז משם. גזור E12.5 ריאות העובר עם קנה הנשימה הגרון שלם מוצג. (CR) באונה גולגולתי, (מד) באונה המדיאלי, (CA) באונה הזנב, (ACC) באונה אביזרים, (לה) באונה השמאלית.

איור 2
איור 2. FGF9 גורם להרחבת mesenchyme ועל התרחבות של האפיתל בריאה לגדל במבחנה. (AC) E12.5 ריאות הוא גדל במשך 48 שעות העדר FGF9. הערה העלייה הסתעפות. (DF) E12.5 הריאות גדל במשך 48 שעות הנוכחות של FGF9. הערה התרחבות של האפיתל וגם mesenchyme מוקדם ככל לאחר 24 שעות של תרבות (E). לאחר 48 שעות (F), ההשפעה על האפיתל הוא מודגש עוד יותר. סולם בר: AF 400 מיקרומטר 4.

פרוטוקול טקסט מלא לגישה זו ניסיוני זמין הפרוטוקולים שפרינגר .

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר סבן קדם דוקטורט במכון (PMDM), ועל ידי NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics