माउस भ्रूणीय फेफड़े संस्कृति, एक शाखाओं में बंटी के आणविक तंत्र का मूल्यांकन सिस्टम

Biology
 

Summary

जल्दी भ्रूण फेफड़ों अंग संस्कृति एक बहुत ही उपयोगी उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन प्रणाली है. विशिष्ट परिस्थितियों है कि इस प्रणाली में आसानी से चालाकी से किया जा सकता है के तहत दोनों उपकला और mesenchymal morphogenesis आय.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

फेफड़े मौलिक रूप में अच्छी तरह के रूप में शाखाओं में बंटी morphogenesis विनिर्देश, और विभिन्न फेफड़े सेल प्रजातियों के गठन उसके आसपास mesenchyme और mesothelium के साथ फेफड़ों endoderm की एक विशिष्ट बातचीत की आवश्यकता है. फेफड़े mesenchyme morphogenesis शाखाओं में फेफड़ों के लिए आगमनात्मक संकेतों के स्रोत होना दिखाया गया है. उपकला-mesenchymal mesothelial बातचीत भी कर रहे हैं भ्रूण फेफड़ों morphogenesis करने के लिए महत्वपूर्ण है. जल्दी भ्रूण फेफड़ों अंग संस्कृति एक बहुत ही उपयोगी उपकला-mesenchymal बातचीत का अध्ययन प्रणाली है. विशिष्ट परिस्थितियों है कि इस प्रणाली में आसानी से चालाकी से किया जा सकता है (मातृ प्रभाव और रक्त प्रवाह के अभाव में) के तहत दोनों उपकला और mesenchymal morphogenesis आय. इससे भी महत्वपूर्ण बात यह तकनीक एक serumless, रासायनिक परिभाषित संस्कृति मीडिया में आसानी से किया जा सकता है है. और समारोह के लाभ और हानि व्यक्त प्रोटीन, पुनः संयोजक वायरल vectors और / या ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों, antisense शाही सेना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शाही सेना हस्तक्षेप जीन पछाड़ना के विश्लेषण का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है है.

Protocol

अंग संस्कृति एक बहुत ही उपयोगी और बहुमुखी तकनीक जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति का अध्ययन है. ये पूर्व vivo संस्कृति तरीकों प्रारंभिक के रूप में या पूरक में vivo अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है .

1. भ्रूण फेफड़े अलगाव

  1. समय गर्भवती चूहों postcoitum दिन 11.5 या 12.5 (E11.5 12.5) पर सीओ 2 narcosis द्वारा NIH और OLAW दिशा निर्देशों के अनुसार बलिदान कर रहे हैं. जानवर एक कक्ष में रखा गया है और 100% सीओ 2 शुरू की है. जानवर के बाद बेहोश है सीओ 2 के प्रवाह में वृद्धि हुई है. जानवर के नैदानिक ​​मौत सुनिश्चित किया जाना चाहिए.
  2. सभी निम्न चरणों के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में बाँझ शर्तों के तहत पूरा किया जाना चाहिए. गर्भवती महिलाओं से गर्भाशय निकाल दिया जाता है. जानवर से गर्भाशय को निकालने के लिए, गर्भवती महिलाओं को अपनी पीठ पर रखा जाता है और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव. एक चीरा पेट में किया जाता है, और त्वचा त्वचा ऊपर की ओर खींच रहा है, जबकि पशु पिछले पैरों धारण करके निकाल दिया जाता है. peritoneal गुहा खोला और गर्भाशय जानवर से हटा दिया जाता है.
  3. रक्त एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ठंड हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) के साथ भरा ट्यूब में गर्भाशय रखकर बंद rinsed है, और ट्यूब 2 मिनट के लिए धीरे हिल है.
  4. गर्भाशय तो त्रिविम विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक पेट्री डिश में रखा है, और भ्रूण गर्भाशय वसंत कैंची का उपयोग कर दीवार incising से गर्भाशय से जारी है. भ्रूण एक छिद्रित चम्मच का उपयोग करने के लिए harvested रहे हैं, और एक नया पेट्री HBSS युक्त पकवान में बर्फ पर रखा है.
  5. त्रिविम विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण फेफड़ों ठंड HBSS (चित्रा 1) से युक्त एक पेट्री डिश में से एक द्वारा विच्छेदित कर रहे हैं.
  6. पृथक भ्रूण फेफड़ों बर्फ पर एक बाँझ हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर HBSS युक्त एक पेट्री डिश में रखा गया है.

2. भ्रूण फेफड़े संस्कृति

  1. 1 मिली लीटर प्रति अच्छी तरह से D-MEM/F-12 की 500 microliters पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 इकाइयों / मिलीलीटर के साथ पूरक एक Nunclon Polystyrene पकवान में जोड़ा जाता है.
  2. एक Nuclepore Polycarbonate ट्रैक नक़्क़ाशी झिल्ली मीडिया के शीर्ष पर रखा गया है. जब Nuclepore Polycarbonate ट्रैक नक़्क़ाशी झिल्ली मीडिया के शीर्ष पर रखा है, सुनिश्चित करें कि चमकदार पक्ष मीडिया, और किसी न किसी पक्ष है ऊपर का सामना करना पड़ के खिलाफ है.
  3. एक विच्छेदित भ्रूण फेफड़ों Nuclepore Polycarbonate ट्रैक नक़्क़ाशी एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग झिल्ली के शीर्ष पर रखा गया है.
  4. भ्रूण फेफड़ों स्थिति संदंश का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है. भ्रूण फेफड़ों फिल्टर पर रखा एक अक्षुण्ण ट्रेकिआ और उनके एक सीधी स्थिति होने ट्रेकिआ के साथ रखा जा करना चाहिए, इस प्रकार सभी फेफड़ों ही आंतरिक दबाव है की अनुमति.
  5. Nunclon Polystyrene पकवान एक सेल इनक्यूबेटर (चित्रा 2) में वांछित संस्कृति समय के लिए स्थानांतरित किया है.

3. माल

1. भ्रूण साबुत फेफड़े अलगाव

  1. समय गर्भवती (C57BL6 जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक) postcoitum 11.5 दिन पर 13.5 (13.5 E11.5 -) के लिए बलिदान किया जा चूहों.
  2. 'हैंक्स संतुलित नमक (HBSS) समाधान (1X), कैल्शियम क्लोराइड, मैग्नीशियम क्लोराइड, या मैग्नीशियम सल्फेट के बिना, तरल. (Invitrogen, Carlsbad, CA) 50 इकाइयों / पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन की मिलीलीटर (Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ पूरक. कमरे के तापमान पर और 4 डिग्री सेल्सियस के उद्घाटन के बाद HBSS स्टोर. विभाज्य और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन
  3. त्रिविम विदारक माइक्रोस्कोप (Leica, Wetzlar, जर्मनी).
  4. Dumont संदंश, ठीक परितारिका कैंची (सीधे), Noyes वसंत कैंची और मोरिया ® चम्मच (छेदा) (ललित विज्ञान उपकरण, फोस्टर शहर, सीए) सहित विच्छेदन उपकरण.

2. भ्रूण साबुत फेफड़े संस्कृति

  1. Dulbecco संशोधित मध्यम ईगल: पोषक तत्व मिक्स एफ 12 (D-MEM/F-12) (1X), तरल, 01:01 एल glutamine होते हैं, लेकिन कोई HEPES बफर. (Invitrogen, Carlsbad, CA) 50 इकाइयों / पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन की मिलीलीटर (Invitrogen, Carlsbad, CA) के साथ पूरक. DMEM/F-12 प्रकाश (जैसे एल्यूमीनियम पन्नी के द्वारा कवर) से दूर बोतल और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस रखें विभाज्य और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन
  2. Nuclepore Polycarbonate ट्रैक नक़्क़ाशी झिल्ली, 8.0 मीटर, 13mm (वाटमान Nuclepore ट्रैक नक़्क़ाशी (वाटमान, Florham पार्क, न्यू जर्सी झिल्ली).
  3. Nunclon lids के साथ Polystyrene पकवान, 4 कुओं (Rochester, NY).
  4. प्रयोज्य स्थानांतरण pipettes, बाँझ (फिशर साइंटिफिक, पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी).

चित्रा 1
चित्रा 1. E12 भ्रूण फेफड़ों के विच्छेदन. (ए) E12.5 पूरे भ्रूण दाईं ओर से देखा (बी) राइट forelimb भ्रूण से हटाया गया है. (सी) संदंश बाएँ हाथ पकड़े पकवान में स्थिर भ्रूण द्वारा आयोजित. तीर (डी) भ्रूण फेफड़ों के पीछे निहित है दिल (हटा विच्छेदन की योजना से संकेत मिलता है) और रीढ़ की हड्डी के लिए पूर्वकाल. यह आंकड़ा त्वचा और दिल हटाने के बाद फेफड़ों से पता चलता है (ई) ग्रसनी हटाने के भ्रूण से बरकरार फेफड़ों की जुदाई की अनुमति देता है (एफ) असंबद्ध ग्रसनी ऊतक और घुटकी दूर की छंटनी की है... Dissected E12.5 बरकरार ट्रेकिआ और गला के साथ भ्रूण फेफड़ों दिखाया गया है. (सीआर) कपालीय पालि, (मेड) औसत दर्जे का पालि, (सीए) दुम पालि, (एसीसी) गौण पालि, Le () वाम पालि.

चित्रा 2
चित्रा 2. FGF9 mesenchyme के विस्तार और इन विट्रो में हो उपकला के फेफड़ों में फैलाव लाती (एसी) E12.5 फेफड़ों FGF9 के अभाव में 48 घंटे के लिए उगाया जाता है. . शाखाओं में बंटी में वृद्धि नोट (लोमो) E12.5 फेफड़ों FGF9 की उपस्थिति में 48 घंटे के लिए हो . उपकला और के रूप में जल्दी के रूप में mesenchyme संस्कृति के 24 घंटे के के बाद (ई) के फैलाव ध्यान दें . (एफ) 48 घंटे के बाद उपकला पर प्रभाव और भी अधिक स्पष्ट है . वायुसेना 400 सुक्ष्ममापी 4: स्केल पट्टी.

इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए पूर्ण पाठ प्रोटोकॉल में उपलब्ध है स्प्रिंगर प्रोटोकॉल .

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

इस काम के Saban अनुसंधान संस्थान पुरस्कार पूर्व डॉक्टरेट (PMDM) द्वारा समर्थित किया गया था, और NIH HL75773 RO1 (DW) के द्वारा.

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
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  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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