마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Biology
 

Summary

초기 배아 폐 기관의 문화는 상피 - mesenchymal 상호 작용을 연구하기 위해 매우 유용한 시스템입니다. 쉽게이 시스템에서 조작할 수있는 구체적인 조건 하에서 상피와 mesenchymal 모두 morphogenesis 진행.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

폐 원시 사양뿐만 아니라 분기 morphogenesis, 다양한 폐 세포 lineages의 형성은 주변 mesenchyme과 mesothelium과 폐 endoderm의 특정 상호 작용을 필요로합니다. 폐 mesenchyme는 폐 분기 morphogenesis을위한 유도 신호의 소스로 표시되었습니다. 상피 - mesenchymal - mesothelial 상호 작용은 또한 배아 폐 morphogenesis에 중요합니다. 초기 배아 폐 기관의 문화는 상피 - mesenchymal 상호 작용을 연구하기 위해 매우 유용한 시스템입니다. 쉽게 (산모 영향과 혈액 흐름의 부재에서)이 시스템에서 조작할 수있는 구체적인 조건 하에서 상피와 mesenchymal 모두 morphogenesis 진행. 더 중요한 것은이 기술은 쉽게 serumless, 화학적으로 정의 문화 미디어로 이루어 질 수 있습니다. 함수의 이득과 손실 표현 단백질, 재조합 바이러스 벡터 및 / 또는 유전자 변형 마우스 변종, 안티 센스 RNA뿐만 아니라 RNA 간섭 유전자 최저 분석을 사용하여 얻을 수 있습니다.

Protocol

오르간 문화는 유전자와 단백질 발현을 연구하기 위해 매우 유용하고 다재 다능한 기술입니다. 이 전 생체내 문화 방법은 사전 또는 생체내 연구에 보완에 사용할 수 있습니다.

1. 배아 룽 절연

  1. 시간 초과 - 임신 생쥐는 NIH와 OLAW 지침에 따라 CO 2 마취법에 의해 postcoitum 일 11.5 또는 12.5 (E11.5 - 12.5)에 희생됩니다. 동물은 챔버에 배치되며 100 % CO 2가 도입됩니다. 동물이 의식이 후 CO 2 흐름이 증가됩니다. 동물의 임상 죽음을 보장해야합니다.
  2. 모든 다음 단계는 층류 후드에서 무균 조건 하에서 완료해야합니다. 자궁은 임신 여성에서 제거됩니다. 동물의 자궁을 제거하려면 임신 여성 자신의 뒤쪽에 위치하고 70 % 에탄올로 뿌렸 수 있습니다. 절개는 복부에 만들어이며, 피부는 동물의 뒷다리를 누른 상태에서 위쪽으로 피부를 당겨 제거됩니다. 복막 캐비티가 열립니다과 자궁은 동물에서 제거됩니다.
  3. 혈액은 추운 행크스 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS)으로 가득 50 ML 원뿔 관에 자궁을 배치 해제 씻어서이며, 튜브가 부드럽게 2 분 누볐어입니다.
  4. 자궁은 다음 입체 해부 현미경 페트리 접시에 배치하고, 배아는 봄 가위를 사용하여 자궁 벽을 절개하여 자궁에서 발표됩니다. 배아는 천공 숟가락을 사용하여 수확하고, HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 얼음에 표시됩니다.
  5. 입체 해부 현미경, 배아 폐가 차가운 HBSS (그림 1)이있는 페트리 접시에 하나씩를 해부하고 있습니다.
  6. 분리된 배아 허파는 살균 전송 피펫을 사용하여 HBSS를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 위치합니다.

2. 배아 룽 문화

  1. 1 밀리리터에 따라 잘 D-MEM/F-12 500 microliters의 페니실린 - 스트렙토 마이신의 50 단위 / ML과 보충은 Nunclon의 폴리스티렌 접시에 추가됩니다.
  2. Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막은 미디어의 상단에 위치합니다. Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막은 미디어의 상단에 배치되면, 빛나는 측면은 미디어, 그리고 거친 면을 위쪽에 직면에 대해되어 있는지 확인합니다.
  3. 해부 배아 폐암은 살균 전송 피펫을 사용하여 Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막 위에 위치합니다.
  4. 배아 폐 위치는 포셉를 사용하여 조정됩니다. 필터에 위치 배아 허파가 손상 기관이 있어야하고 바로 입장을 가지고 그들의기도와 배치, 따라서 모든 폐 같은 내부 압력을 가지고 있도록합니다.
  5. Nunclon의 폴리스티렌 요리는 세포 배양기 (그림 2)에서 원하는 문화 시간에 전송됩니다.

3. 자료

1. 배아 전체 룽 격리

  1. 시간이 초과되었습니다 - 임신 (C57BL6 야생 입력하거나 유전자 변형) 생쥐 13.5 (E11.5 - 13.5)에 postcoitum 일 11.5에 희생 될 수 있습니다.
  2. 염화칼슘, 염화 마그네슘 또는 마그네슘 황산없이 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) (1X), 액체,. (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 50 단위 / 페니실린 - 스트렙토 마이신의 ML (Invitrogen, 칼스 배드, CA)과 보완. 실온에서 4 ° C에서 개통 후 HBSS를 저장합니다. 나누어지는하고 보관 -20 ° C.에 페니실린 - 스트렙토 마이신
  3. 입체 해부 현미경 (Leica, Wetzlar, 독일).
  4. 더몬트 포셉, 파인 이리스 가위 (직선), 노예스 봄 가위와 모리아 ® 스푼 (천공) (파인 과학 도구, 포스터 시티, CA)를 포함 해부로드 공구를 추천하십시오.

2. 배아 전체 룽 문화

  1. 중간 Dulbecco의 수정된 이글 : 영양소 믹스 F - 12 (D-MEM/F-12) (1X), 액체, 1:1 L - 글루타민을 포함하지,하지만 HEPES 버퍼. (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 50 단위 / 페니실린 - 스트렙토 마이신의 ML (Invitrogen, 칼스 배드, CA)과 보완. 4 DMEM/F-12 거리 조명 (예 : 알루미늄 호일에 포함)의 병 및 저장 ° C. 유지 나누어지는하고 보관 -20 ° C.에 페니실린 - 스트렙토 마이신
  2. Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막, 8.0 - M, 13mm (왓먼 Nuclepore 트랙 엣지 멤브레인 (왓먼, 플로럼 공원, NJ).
  3. 뚜껑과 Nunclon의 폴리스티렌 요리, 4 우물 (로체스터, NY).
  4. 일회용 전송 pipettes, 멸균 (피셔 과학, 피츠버그, PA).

그림 1
그림 1. E12 배아 폐의 해부. (A) E12.5 전체 난자는 오른쪽에서 볼. (B)를 마우스 오른쪽 forelimb이 배아에서 제거되었습니다. (C) 집게는 접시에 안정적인 배아를 들고 왼손으로 개최. 화살표가 (D) 배아의 폐 마음 (제거하기 위해 사후 거짓말을 해부의 계획을 나타냅니다척추)과 앞쪽에. 이 그림은 피부와 심장 제거 후 폐를 보여줍니다. (E) 인두 제거는 배아의 손상 폐 분리 수 있습니다. (F) 외부 pharyngeal 조직과 식도가 떨어진 손질했습니다. 그대로 기관과 후두와 해부 E12.5 배아 폐암이 표시됩니다. (CR) 두개골 엽 (클럽메드) 중간 엽 (CA) 꼬리의 엽 (ACC) 액세서리 엽 (르) 왼쪽 엽.

그림 2
그림 2. FGF9은 mesenchyme의 확장과 체외에서 성장 폐암에서 상피의 팽창을 유도. (AC) E12.5 폐가 FGF9의 부재에서 48 시간 동안 성장합니다. 분기의 증가에 유의하십시오. (DF) E12.5 폐는 FGF9의 존재에 48 시간 동안 성장. 문화 24 시간 후 빠르면 상피와 mesenchyme (E)의 팽창을 확인합니다. 48시간 (F) 후, 상피에 대한 효과는 더욱 발음입니다. 스케일 바 : AF 400 μm의 4.

이 실험 방법에 대한 전체 텍스트 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 스프링거 프로토콜 .

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

이 작품은 Saban 연구소 사전 박사 수상 (PMDM)에서 지원하고, NIH RO1 HL75773 (DW)에 의해.했습니다

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
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  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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