Cultura do mouse pulmão embrionário, um sistema para avaliar os mecanismos moleculares de Ramificação

Biology
 

Summary

Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

Especificação de pulmão primordial, assim como morfogênese de ramificação, ea formação de várias linhagens de células pulmonares requer uma interação específica da endoderme pulmão com seu mesênquima circundante e mesotélio. Mesênquima pulmonar tem se mostrado ser a fonte de sinais indutivos para morfogênese de ramificação de pulmão. Epitélio-mesenquimais-mesothelial interações também são fundamentais para morfogênese pulmão embrionário. Cultura de órgão embrionário de pulmão é um sistema muito útil para estudar interações epitélio-mesenquimais. Ambos epiteliais e mesenquimais procede morfogênese em condições específicas que podem ser facilmente manipulados neste sistema (na ausência de influência materna e do fluxo sanguíneo). Mais importante ainda esta técnica pode ser facilmente feito em um serumless, meios de cultura quimicamente definido. Ganho e perda de função pode ser conseguido usando proteínas expressas, vetores virais recombinantes e / ou análise de linhagens de camundongos transgênicos, RNA antisense, bem como knockdown do gene RNA de interferência.

Protocol

Cultura de órgãos é uma técnica muito útil e versátil para o estudo do gene e expressão da proteína. Estes métodos de cultura ex vivo pode ser usado como preliminar ou em complemento a estudos in vivo.

1. Isolamento Lung embrionárias

  1. Cronometrado grávidas ratos são sacrificados no dia postcoitum 11,5 ou 12,5 (E11.5-12.5) pelo CO 2 narcose acordo com as diretrizes do NIH e OLAW. O animal é colocado em uma câmara de CO 2 e 100% é introduzido. Depois que o animal está inconsciente o fluxo de CO 2 é maior. Morte clínica do animal deve ser assegurada.
  2. Todos os passos seguintes devem ser concluídas em condições estéreis em capela de fluxo laminar. O útero é removido as fêmeas grávidas. Para remover o útero do animal, as fêmeas grávidas são colocados em suas costas e pulverizadas com etanol 70%. É feita uma incisão no abdômen, ea pele é removida por puxar a pele para cima, mantendo as patas traseiras do animal. A cavidade peritoneal é aberta eo útero é retirado do animal.
  3. O sangue é retirado com água, colocando o útero em um tubo de 50 ml cheio de frio Solução Salina Balanceada Hanks (HBSS), eo tubo é suavemente embalado por 2 minutos.
  4. O útero é então colocado em uma placa de Petri sob o microscópio estereoscópico de dissecação, e os embriões liberados do útero por uma incisão na parede uterina usando uma tesoura primavera. Os embriões são colhidos usando uma colher perfurada, e colocado no gelo em uma placa de Petri contendo novas HBSS.
  5. Sob o microscópio estereoscópico de dissecação, pulmões embrionárias são dissecados, um por um numa placa de Petri contendo HBSS frio (Figura 1).
  6. O pulmão isolado embrionárias é colocado sobre o gelo em uma placa de Petri contendo HBSS usando uma pipeta de transferência estéril.

2. Cultura Lung embrionárias

  1. 500 microlitros de 1 mililitro por poço de D-MEM/F-12 suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina é adicionado em um prato de poliestireno Nunclon.
  2. A membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia. Quando a membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch é colocado em cima da mídia, certifique-se que o lado brilhante é contra a mídia, e é lado áspero para cima.
  3. Um pulmão dissecados embrionário é colocado em cima da membrana de policarbonato Nuclepore Track-Etch usando uma pipeta de transferência estéril.
  4. A posição de pulmão embrionário é ajustado com o fórceps. Pulmão embrionário colocada no filtro deve ter uma traquéia intacta e ser colocado com a traquéia ter uma posição reta, permitindo assim que todos os pulmões para ter a mesma pressão interna.
  5. O prato de poliestireno Nunclon é transferido para a cultura desejada tempo em uma incubadora de células (Figura 2).

3. Materiais

1. Isolamento de pulmão embrionário Whole

  1. Timed-grávidas (C57BL6 tipo selvagem ou transgênicos) ratos para ser sacrificado no dia postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5).
  2. Solução de Hanks salina balanceada (HBSS) (1X), líquido, sem cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, ou sulfato de magnésio. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Armazenar o HBSS à temperatura ambiente ea 4 ° C após a abertura. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
  3. Estereomicroscópio estereoscópico (Leica, Wetzlar, Alemanha).
  4. Ferramentas de dissecção incluindo Dumont pinças, tesouras Belas íris (reta), mola Noyes tesoura e uma colher Moria ® (perfurada) (Ferramentas Ciência Fine, Foster City, CA).

2. Cultura Lung embrionárias Whole

  1. Modificado Dulbecco Eagle Medium: Mix de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) (1X), líquido, 01:01 Contém L-glutamina, mas nenhum tampão HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA), suplementado com 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Manter o frasco DMEM/F-12 longe da luz (por exemplo, cobertas por folhas de alumínio) e armazenar a 4 ° C. Alíquotas e armazenar a penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
  2. Nuclepore Policarbonato Membrana Track-Etch, 8,0 m, 13 mm (Whatman Nuclepore membrana Track-Etch (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Nunclon prato com tampas de poliestireno, 4 poços (Rochester, NY).
  4. Pipetas de transferência descartável, estéril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figura 1
Figura 1. Dissecção da E12 pulmões embrionárias. (A) E12.5 embrião todo visto do lado direito. (B) membro direito foi removida do embrião. (C) Pinça realizada pela mão esquerda segurando o embrião constante no prato. Setas indicam plano de dissecção (D) pulmão embrionárias está posterior ao coração (removido) E anterior à coluna vertebral. Esta figura mostra os pulmões após a remoção de pele e coração. (E) a remoção Faringe permite a separação do pulmão intacto do embrião. (F) de tecido da faringe e esôfago Extraneous foram cortadas fora. Dissecados pulmão E12.5 embrionárias com traquéia e laringe intacta é mostrado. (Cr) lobo cranial, (Med) lobo Medial, (Ca) lobo caudal, (Acc) lobo acessório, (Le) lobo esquerdo.

Figura 2
Figura 2. FGF9 induz expansão do mesênquima ea dilatação do epitélio no pulmão cultivadas in vitro. (AC) E12.5 pulmão é cultivada por 48 horas na ausência de FGF9. Observe o aumento da ramificação. (DF) pulmão E12.5 crescido por 48 horas em presença de FGF9. Observe a dilatação do epitélio e mesênquima logo após 24 horas de cultura (E). Após 48 horas (F), o efeito sobre o epitélio é ainda mais pronunciada. Barra de escala: AF M 400 4.

O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em Protocolos Springer .

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa Saban Prêmio Pré-doutorado (PMDM), e pelo NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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