Embrionali di topo Cultura Lung, un sistema per valutare i meccanismi molecolari della Branching

Biology
 

Summary

Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

Specifiche del polmone primordiale così come morfogenesi ramificazione, e la formazione di varie linee cellulari polmonare richiede una interazione specifica del polmone endoderma con i suoi mesenchima circostante e mesotelio. Mesenchima del polmone ha dimostrato di essere la fonte di segnali induttivi per la morfogenesi del polmone ramificazione. Epitelio-mesenchimale-mesoteliali interazioni sono anche fondamentali per la morfogenesi del polmone embrionale. Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema (in assenza di influenza materna e il flusso di sangue). Ancora più importante questa tecnica può essere facilmente fatto in un serumless, terreni di coltura chimicamente definite. Guadagno e perdita della funzione può essere raggiunto utilizzando proteine ​​espresse, vettori virali ricombinanti e / o analisi dei ceppi di topi transgenici, RNA antisenso, così come knockdown interferenza dell'RNA del gene.

Protocol

Cultura d'organo è una tecnica molto utile e versatile per lo studio dell'espressione genica e proteica. Questi metodi di coltura ex vivo può essere utilizzato come preliminare o in modo complementare agli studi in vivo.

1. Polmone embrionale di isolamento

  1. Cronometrato in gravidanza topi vengono sacrificati il giorno postcoitum 11,5 o 12,5 (E11.5-12.5) narcosi da CO 2 secondo le linee guida NIH e OLAW. L'animale è posto in una camera e 2 CO 100% è introdotto. Dopo che l'animale è incosciente il flusso di CO 2 è aumentata. La morte clinica degli animali deve essere garantita.
  2. Tutte le seguenti operazioni devono essere completate in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare. L'utero viene rimosso dalle femmine gravide. Per rimuovere l'utero dall'animale, le femmine gravide sono posizionati sul dorso e spruzzato con il 70% di etanolo. Un'incisione è fatta nell'addome, e la pelle viene rimossa tirando la pelle verso l'alto tenendo le zampe posteriori dell'animale. La cavità peritoneale è aperta e l'utero viene rimosso dal animale.
  3. Il sangue è risciacquate mettendo l'utero in un tubo da 50 ml conica riempita con la soluzione a freddo sale Hanks Bilanciato (HBSS), e il tubo è cullati dolcemente per 2 minuti.
  4. L'utero è poi posto in una capsula di Petri sotto il microscopio stereoscopico dissezione, e gli embrioni liberati dall'utero di incidere la parete uterina con le forbici a molla. Gli embrioni vengono raccolte con un mestolo forato, e immessi sul ghiaccio in un nuovo piatto di Petri contenenti HBSS.
  5. Sotto il microscopio stereoscopico dissezione, i polmoni embrionali sono sezionati uno ad uno in una capsula di Petri contenente HBSS freddo (Figura 1).
  6. Il polmone isolato embrionale è immesso sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente HBSS con una pipetta sterile trasferimento.

2. Cultura polmone embrionale

  1. 500 microlitri a 1 millilitro di D-MEM/F-12 ben integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina viene aggiunto in un piatto di polistirolo Nunclon.
  2. Un Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posta sulla parte superiore del supporto. Quando il Nuclepore policarbonato Track-Etch membrana è posto sulla parte superiore del supporto, accertarsi che il lato lucido è contro i media, e parte ruvida è rivolto verso l'alto.
  3. Un polmone sezionato embrionale è posto sulla parte superiore del policarbonato Nuclepore Track-Etch a membrana con una pipetta sterile trasferimento.
  4. La posizione del polmone embrionale viene regolata utilizzando il forcipe. Polmone embrionale immessi sul filtro dovrebbe avere un trachea intatto ed essere posizionati con le loro trachea avere una posizione diritta, consentendo così a tutti i polmoni di avere la stessa pressione interna.
  5. Il piatto polistirene Nunclon è trasferita per il tempo desiderato cultura in un incubatore cella (Figura 2).

3. Materiale

1. Embrionale isolamento intero polmone

  1. Temporizzata in gravidanza (C57BL6 wild-type o transgenici) topi essere sacrificato il giorno postcoitum 11,5-13,5 (E11.5-13.5).
  2. Sale Hanks 'soluzione equilibrata (HBSS) (1X), liquido, senza cloruro di calcio, cloruro di magnesio o solfato di magnesio. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Conservare il HBSS a temperatura ambiente ed a 4 ° C dopo l'apertura. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C.
  3. Stereoscopico microscopio da dissezione (Leica, Wetzlar, Germania).
  4. Strumenti di dissezione tra cui Dumont pinze, forbici Belle iris (diritto), Noyes forbici primavera e Moria cucchiaio ® (forato) (Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA).

2. Embrionale Cultura intero polmone

  1. Dulbecco Modified Media Aquila: Mix nutrienti F-12 (D-MEM/F-12) (1X), liquido, 1:1 Contiene L-glutamina, ma nessun tampone HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) integrata con 50 unità / ml di penicillina-streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tenere il DMEM/F-12 bottiglia al riparo dalla luce (ad esempio coperto da un foglio di alluminio) e conservare a 4 ° C. Aliquota e memorizzare la penicillina-streptomicina a -20 ° C.
  2. Nuclepore policarbonato Track-Etch a membrana, 8.0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrana (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Nunclon piatto di polistirolo con coperchio, 4 pozzi (Rochester, NY).
  4. Pipette di trasferimento monouso, sterili (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figura 1
Figura 1. Dissezione di E12 polmoni embrionale. (A) E12.5 embrione tutto visto dal lato destro. (B) zampa anteriore destra è stato rimosso dall'embrione. (C) Pinza teneva per la mano sinistra regge l'embrione costante nel piatto. Le frecce indicano piano di dissezione (D) del polmone embrionale si trova posteriormente al cuore (rimossa) E anteriore alla colonna vertebrale. Questa figura mostra i polmoni dopo la rimozione della pelle e del cuore. (E) la rimozione Faringe consente la separazione del polmone intatto dall'embrione. (F) estranei tessuto della faringe ed esofago sono stati tagliati via. Sezionato E12.5 polmone embrionale con la trachea e della laringe intatta viene mostrato. (Cr) lobo craniale, (Med) lobo mediale, (Ca) lobo caudale, (Acc) lobo accessorio, (Le) lobo sinistro.

Figura 2
Figura 2. FGF9 induce espansione del mesenchima e la dilatazione dei polmoni in epitelio coltivate in vitro. (AC) E12.5 polmonare è cresciuto per 48 ore in assenza di FGF9. Si noti l'aumento della ramificazione. (DF) E12.5 polmone cresciuto per 48 ore in presenza di FGF9. Si noti la dilatazione dei epitelio e mesenchima già dopo 24 ore di cultura (E). Dopo 48 ore (F), l'effetto sul epitelio è ancora più pronunciato. Scala grafica: AF 400 micron 4.

Il protocollo testo completo di questo approccio sperimentale è disponibile in protocolli di Springer .

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Saban Research Institute di pre-dottorato Award (PMDM), e dal NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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