Embryonalen Maus-Lung Kultur, A-System, die molekularen Mechanismen des Branching Bewerten

Biology
 

Summary

Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

Lung ursprüngliche Spezifikation sowie Verzweigung Morphogenese und die Bildung von verschiedenen Lungenerkrankungen Zelllinien erfordert eine spezifische Wechselwirkung der Lunge Entoderm mit seinen umliegenden Mesenchym und Mesothel. Lung Mesenchym hat sich gezeigt, dass die Quelle der induktive Signale für Lungen-Verzweigung Morphogenese werden. Epithelial-mesenchymale-mesothelial Wechselwirkungen sind auch entscheidend für die embryonale Lunge Morphogenese. Frühen embryonalen Lunge Organkultur ist ein sehr nützliches System epithelial-mesenchymale Interaktionen zu untersuchen. Beide epithelialen und mesenchymalen Morphogenese Erlös unter bestimmten Bedingungen, die leicht in das System manipuliert werden kann (in der Abwesenheit der Mutter beeinflusst und die Durchblutung). Noch wichtiger ist diese Technik kann leicht in einer serumless, chemisch definierten Kulturmedien erfolgen. Gewinn und Verlust der Funktion kann mit Hilfe exprimierten Proteine, rekombinante virale Vektoren und / oder Analyse von transgenen Maus-Stämme, Antisense-RNA, sowie RNA-Interferenz-Gen Knockdown werden.

Protocol

Orgel Kultur ist eine sehr nützliche und vielseitige Technik zur Gen-und Proteinexpression zu untersuchen. Diese ex vivo Kultur Methoden können als Vor-oder in Ergänzung zu den in-vivo-Studien verwendet werden.

1. Embryonale Lung Isolation

  1. Timed-trächtigen Mäusen auf postcoitum Tag 11,5 oder 12,5 (E11.5-12.5) von CO 2 Narkose nach dem NIH und OLAW Richtlinien geopfert. Das Tier ist in einer Kammer platziert und 100% CO 2 wird eingeführt. Nachdem das Tier bewusstlos ist der CO 2-Strom wird erhöht. Klinische Tod des Tieres muss gewährleistet sein.
  2. Alle folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank abgeschlossen sein. Die Gebärmutter ist von der trächtigen Weibchen entfernt. Zum Entfernen der Gebärmutter aus dem Tierreich sind die trächtigen Weibchen auf den Rücken gelegt und versprüht mit 70% Ethanol. Ein Schnitt in der Bauchdecke, und die Haut wird durch Ziehen der Haut nach oben, während das Tier Hinterbeine entfernt. Die Bauchhöhle wird geöffnet und die Gebärmutter ist aus dem Tier entfernt.
  3. Das Blut wird durch Platzierung der Gebärmutter in einer 50 ml konische Röhrchen mit kaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) gefüllt gespült, und das Rohr ist leicht für 2 Minuten rockten.
  4. Die Gebärmutter wird dann in einer Petrischale unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop gelegt, und die Embryonen aus der Gebärmutter durch Einschneiden der Gebärmutterwand mit Feder Schere freigegeben. Die Embryonen werden geerntet mit einem perforierten Löffel, und auf Eis in eine neue Petrischale mit HBSS.
  5. Unter dem stereoskopischen Präpariermikroskop, sind embryonale Lunge eins nach dem anderen in eine Petrischale mit kaltem HBSS (Abbildung 1) zerlegt.
  6. Die isolierten embryonalen Lunge ist auf Eis in eine Petrischale mit HBSS mit einer sterilen Transferpipette platziert.

2. Embryonale Lung Kultur

  1. 500 Mikroliter bis 1 Milliliter pro Vertiefung D-MEM/F-12 mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin ergänzt ist in einem Nunclon Polystyrol Gericht aufgenommen.
  2. Ein Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran ist auf der Oberseite der Medien gelegt. Wenn die Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran auf der Oberseite des Media platziert wird, stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite gegen die Medien und raue Seite nach oben zeigt ist.
  3. Ein seziert embryonalen Lunge ist auf der Oberseite des Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran mit einer sterilen Transferpipette platziert.
  4. Die embryonalen Lungen-Position wird mit Hilfe der Zange. Embryonale Lunge auf dem Filter gesetzt haben sollte eine intakte Luftröhre und ihre Luftröhre mit einer geraden Position gebracht werden, so dass alle Lunge zu den gleichen Innendruck haben.
  5. Die Nunclon Polystyrol Gericht ist für die gewünschte Kultur Uhrzeit in eine Zelle Inkubator (Abbildung 2) übertragen.

3. Materialien

1. Embryonale Whole Lung Isolation

  1. Timed-schwanger (C57BL6 Wildtyp oder transgene) Mäuse auf postcoitum Tag 11,5 bis 13,5 (E11.5-13.5) geopfert werden.
  2. Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssig, ohne Calciumchlorid, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Bewahren Sie die HBSS bei Raumtemperatur und bei 4 ° C nach dem Öffnen. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C.
  3. Stereoscopic Präpariermikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland).
  4. Dissection-Tools einschließlich Dumont Pinzetten, Fine Iris Schere (gerade), Noyes Frühjahr Schere und Moria ® Löffel (perforiert) (Fine Science Tools, Foster City, CA).

2. Embryonale ganze Lunge Kultur

  1. Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1x), flüssig, noch 1:1 L-Glutamin, aber keine HEPES-Puffer. (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 50 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ergänzt. Halten Sie die DMEM/F-12 Flasche weg vom Licht (z. B. durch Aluminiumfolie abgedeckt) und lagern bei 4 ° C. Aliquotieren und speichern Sie die Penicillin-Streptomycin bei -20 ° C.
  2. Nuclepore Polycarbonat Track-Etch-Membran, 8,0-m, 13 mm (Whatman Nuclepore Track-Etch-Membran (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Nunclon Polystyrol Schüssel mit Deckel, 4 Vertiefungen (Rochester, NY).
  4. Einweg Transferpipetten, sterile (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Abbildung 1
Abbildung 1. Präparation E12 embryonalen Lunge. (A) E12.5 ganze Embryo von der rechten Seite angezeigt. (B) mit der rechten Vorderbein aus dem Embryo entfernt worden ist. (C) Pinzetten von der linken Hand des Embryos stetig in die Schüssel gehalten. Die Pfeile zeigen Plan der Dissektion (D) Embryonale Lunge liegt hinter dem Herzen (entfernt) Und vor der Wirbelsäule. Diese Abbildung zeigt die Lunge nach Haut-und Herz Entfernung. (E) Pharynx Entfernung Trennung der intakten Lunge ermöglicht aus dem Embryo. (F) Überflüssige pharyngeale Gewebe und Speiseröhre wurden abgeschnitten. Dissected E12.5 embryonalen Lunge mit intakten Luftröhre und Kehlkopf wird angezeigt. (Cr) Cranial Lappen, (Med) Medial Lappen, (Ca) Schwanzflossenlappen, (Acc) Zubehör Lappen, (Le) linken Lappen.

Abbildung 2
Abbildung 2. FGF9 induziert Erweiterung des Mesenchyms und der Dilatation des Epithels in der Lunge in vitro gezüchtet. (AC) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Abwesenheit von FGF9 angebaut wird. Notieren Sie sich die Zunahme der Verzweigung. (DF) E12.5 Lunge für 48 Stunden in Anwesenheit von FGF9 gewachsen. Beachten Sie die Erweiterung des Epithel und Mesenchym bereits nach 24 Stunden Kultur (E). Nach 48 Stunden (F), ist die Wirkung auf das Epithel noch stärker ausgeprägt. Maßstab: AF 400 um 4.

Der vollständige Text Protokoll für diesen experimentellen Ansatz ist in Springer Protocols .

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Saban Research Institute Pre-Doc-Award (PMDM) unterstützt und von NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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