التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي

Biology
 

Summary

هذا البروتوكول صورة توضح كيفية البروتين البروتين التفاعلات باستخدام مقايسة القرب الحنق مقرا لها.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Seegar, T., Barton, W. Imaging Protein-protein Interactions in vivo. J. Vis. Exp. (44), e2149, doi:10.3791/2149 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

البروتين البروتين التفاعلات هي السمة المميزة لجميع العمليات الخلوية الأساسية. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه التفاعلات هي عابرة ، أو ضعيفة بقوة ، ومنع التعرف عليهم من خلال وسائل التحليل والكيمياء الحيوية التقليدية مثل مناعي المشترك. في هذا الصدد ، فإن البروتينات الفلورية encodable وراثيا (GFP ، RFP ، الخ) وما يرتبط بها من تداخل الطيف مضان أحدثت ثورة في قدرتنا على رصد التفاعلات الضعيفة في الجسم الحي باستخدام الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق) 1-3. هنا ، ونحن من التفصيل استخدامنا لفحص القرب الحنق مقرها لرصد التفاعلات مستقبلات مستقبلات على سطح الخلايا البطانية.

Protocol

بروتوكول يتكون من ثلاث خطوات رئيسية. الأولى ، والاستنساخ الجيني خطوة من اهتمامك في الثدييات التعبير سوف تناقش ناقلات الأميني الميئوس من إصدارات موحودي و / أو CFP YFP يكون إلا لفترة وجيزة. وترد ترنسفكأيشن من الحمض النووي المتجه الى EA.hy926 الخلايا البطانية ، والتصوير مبائر مع الحنق ، على نحو أكثر عمقا أدناه ؛ الخطوات الثانية والثالثة.

1. بناء المستقبلات CFP YFP وهمي

وينبغي الاهتمام المستنسخة مستقبلات الأميني الميئوس من إصدارات محسنة من موحودي CFP وYFP. تقرير من الحنق والتجريبية واعتمادا كبيرا على طول رابط بين الممتدة عبر الغشاء المنطقة وبدء fluorophore 1. لذا ، لا بد من استكشاف أطوال مختلفة من رابط لكل زوج مستقبلات جديدة في إطار التحقيق.

  1. R في الرطوبة أو pcDNA3.1 الجدد ناقلات R أو التي تحتوي على C - موحودي YFP (يمكن الحصول على هذه النواقل من مختبرنا) ، مستقبلات استنساخ اهتمامك في مواقع NheI / EcoRI. * ملاحظة ، إذا لزم الأمر ، NheI متوافق إنزيمات عديدة أخرى بما في ذلك SpeI وXbaI.
  2. تحويل ردة فعلك في مناسبة ربط خط recA endA1 الخلية المختصة (التي نستخدمها بشكل روتيني Mach1). تليها المستعمرات الشاشة عن وجود تسلسل الحمض النووي التي تضاف للتحقق من عدم وجود طفرات.
  3. بعد الحصول على التشكل الاستنساخ الجزيئي الناجحة ، وإعداد ترنسفكأيشن الصف الحمض النووي في ناقلات مياه معقمة أو TE Qiagen به ، أو ما شابه ذلك مجموعات الحمض النووي. تقييم التركيز والنقاء باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. وينبغي أن الغلة تكون نموذجية من الحمض النووي في نطاق 100-200 ميكروغرام ، والتي تضعف بشكل روتيني لعمل البورصة 1 ميكروغرام / ميكرولتر.

2. ترنسفكأيشن من خلايا 926 EA.hy

  1. انقسام الخلايا EA.hy 926 4 ، ونمت في DMEM - كاملة (+10 ٪ DMEM مصل بقري جنيني + Pen. / بكتيريا) في ساترة ماتيك (رقم 0) 35 ملم مع أطباق المتوسطة مل 2. يمكنك الحصول على أطباق متحفظ ~ 15 (~ 90 ٪ متكدسة في اليوم التالي) من طبق متموجة 15 سم. إعداد طبق واحد لتقييم التعبير عن كل مستقبلات الفردية ، فضلا عن طبق واحد لكل زوج مستقبلة.
  2. السماح للخلايا لاحتضان بين عشية وضحاها في الغلاف الجوي بنسبة 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الثقافات ~ متموجة 70-90 ٪.
  3. يوم ترنسفكأيشن ، وإعداد مجمعات nucleolipid بمزج 2 ميكروغرام من الحمض النووي لمستقبلات ناقلات خيالية (2 ميكرولتر) مع 8 ميكرولتر من Fugene6 في 200 ميليلتر من قبل تحسنت OptiMEM. لأزواج المستقبلة ، مع transfect 1 ميكروغرام لكل المستقبلة ، أي ما مجموعه 2 ميكروغرام (انظر أيضا المناقشة الواردة أدناه).
  4. المزيج بلطف بواسطة انقلاب.
  5. يواصل احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. خلال فترة الحضانة ، وإعداد الخلايا لترنسفكأيشن. نضح قبالة الإعلام الطازجة وتغسل كل لوحة بلطف لفترة وجيزة مع PBS دافئة قبل إضافة 2 مل من قبل تحسنت DMEM - كاملة دون مضادات حيوية (DMEM + FBS). فمن الأهمية بمكان تجنب وجود البنسلين والستربتوميسين ، لأنها أكثر بكثير السامة للخلايا أثناء العلاج مع Fugene6.
  7. إضافة قطرة من الحكمة أن خلايا معقدة واحتضان لساعات إضافية في 20-24 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2.
  8. بعد 24 ساعة ، نضح بعناية وسائل الإعلام من الخلايا وماصة جديدة كاملة ، DMEM بالمضادات الحيوية. ترنسفكأيشن التالية ، يجب بقاء الخلية لا تزال مرتفعة نسبيا ، أي يجب أن يذكر لاحظ وجود خلايا العائمة.
  9. التعبير الجيني هو القصوى عادة بعد ساعات إضافية 48-60 بعد ترنسفكأيشن. ومع ذلك ، والتصوير هو ممكن عادة في قصيرة بقدر 24 ساعة. وينبغي إجراء تجارب دوام للتعبير الجين الأمثل.

3. مبائر التصوير والتحليل الحنق

يتم إجراء التصوير الخلية الحية على مجهر لايكا AOBS TCS - SP2 ليزر متحد البؤر المسح مجهزة الصمام الثنائي الأزرق (405 نانومتر) ، الأرجون (458 ، 476 ، 488 ، 514 نانومتر). الأخضر HeNe (543 نانومتر) ، والبرتقال HeNe (594 نانومتر) ، والأحمر HeNe (633 نانومتر) ليزر ، وهو PI HCX آبو 63x/1.3 غ عدسة الهدف الجليسرين ، الغمر ، وهي مرحلة XY بمحركات (Märzhäuser) ، وتسيطر عليها بيئيا ( درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون 2) مرحلة الحاضنة (PeCon). ضوابط تجريبية حاسمة للقضاء على fluorophore عبر نقاش بين القنوات الانبعاثات وكذلك لتقييم قضايا التعبير وغير محددة multimerization fluorophore. على هذا النحو ، تستخدم transfections fluorophore واحد لاقامة الدورة كل صورة. الحنق السلبية الضوابط (المعروفة باستخدام مستقبلات noninteracting) سيكون من الضروري القيام بها ، من أجل تحديد الخلفية الحنق الذي يحدث نتيجة لأكثر من التعبير.

  1. للقضاء على الحديث المتبادل بين القنوات الانبعاثات لCFP وYFP ، ضع تحكم التعبير CFP في حاضنة المرحلة. استخدام الضوء الأبيض ، وضبط Z - لوح إلى التركيز علىإلى الخلايا.
  2. تعيين إعدادات النافذة ليرة سورية للكشف عن انبعاث CFP إلى 465-505 نانومتر ، وYFP إلى 525-600 نانومتر.
  3. في حين رصد كل القنوات الانبعاثات ، تثير CFP في 458 نانومتر. باستخدام AOTF ، تعيين قوة الليزر للقضاء على تنزف ملموس أكثر من CFP في القناة YFP الانبعاثات. حفظ هذا الإعداد.
  4. مراقبة أداء نفس الحديث المتبادل YFP (باستخدام تعبير السيطرة YFP) في قناة CFP عن طريق ضبط قوة الإثارة في 514 نانومتر لخلايا معربا عن YFP فقط. حفظ هذا الإعداد.
  5. خلايا المكان التالي شارك في التعبير عن وCFP YFP في حاضنة المرحلة. تسلسل باستخدام الإعداد للبرنامج مبائر ايكا ، حدد الخلايا معربا عن مستويات مماثلة من CFP وYFP مع التعريب الغشاء المناسب.
  6. باستخدام البرمجيات متقبل لايكا الصور تبيض البرنامج ، تعيين إعدادات المانحة ومتقبل لCFP المحفوظة والإعدادات YFP ، يثير الاحترام.
  7. التكبير على الخلية ، وتسليط الضوء على عائد استثمار (منطقة المصالح) الذي صور الدمار من YFP هو تحدث على الغشاء الخلوي والبدء في البرنامج.
  8. لتدمير صورة للمتقبل ، وضبط AOTF إلى 100 ٪ في 514 نانومتر ، والسماح ليزر تبييض أن تستمر حتى استنفد 70 ٪ من الانبعاثات YFP. لتسريع التبييض ، وعادة ما يتم اختيار رويس في محور النقطية من الليزر (X - المحور).
  9. أثناء التبييض ، الصورة ، رصد حركة الخلوية ورفض الحصول على القياسات مع حركة ملموس في الطائرة - XY ، وهذه القياسات يمكن تقرير كاذب الحنق الكفاءة.
  10. وتسجل الصور قبل وبعد التبييض ، لكل من الجهات المانحة (CFP) ، والمتقبلة (YFP) والحنق وتحسب الكفاءة على النحو التالي : المؤسسة فكرة الحنق = (D - D قبل آخر) / D آخر للجميع آخر D> D حيث D مسبقا قبل ودال آخر هو شدة المانحة قبل وبعد photobleaching على التوالي.
  11. يتم استخدام برامج أحزاب اللقاء المشترك (SAS) لتحديد مدى تقلب التجريبية.

4. ممثل النتائج

ترنسفكأيشن الكفاءة وعادة ما بين 30 إلى 40 ٪. على الرغم من النتائج السابقة من قبل الآخرين ، ونحن لم نر أن ترنسفكأيشن والتعبير واحدة من ناقلات تفضل أن الطرف الآخر. في الواقع ، نلاحظ في كثير من الأحيان التعبير الحصري لأحد fluorophore الوهم أو ذاك. الحنق نموذجية الكفاءة تختلف بين النظم مستقبلة. لمستقبلات نظام التعادل ، والقيم النموذجية هي 20-28 ٪ للخلايا الظهارية و19-23 ٪ في الخلايا البطانية. لعناصر سلبية ، إلا أن الكفاءة النموذجية هي (2-3 ٪) أدناه. ومدى التباين انخفاض كبير من ذوي الخبرة.

الشكل 1
الشكل 1. ممثل صور transfected الخلايا EA.hy 926 ألف صورة) من مدينة دبي للإنترنت أحادي الطبقة EA.hy الخلية 926. ب) صورة من الخلايا الإسفار المعروضة في (A). C) تراكب من (أ) و (B) ~ يتظاهرون كفاءة ترنسفكأيشن 20-30 ٪.

الشكل 2
الشكل 2. ممثل متقبل الصور تبيض تحليل الحنق التي تحدث بين CFP وYFP في زنزانة EA.hy926. انبعاث CFP قناة (لوحات أعلى) والانبعاثات YFP قناة (أسفل فريقين) تم رصدها قبل وحدة photobleaching متقبل آخر. اقتصرت التجارب Photobleaching ل، والحنق من القيم المحسوبة ، ومنطقة داخل المربع الأخضر. يتم عرض الحنق والكفاءة المطلقة من مجموعة عالية (الحمراء 1.0) إلى الأقل (0.0 الأرجواني) على تراكب لتضخيم CFP / YFP دمج الصور لأغراض التوجيه فقط.

Discussion

هناك العديد من الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح. وأبرز هؤلاء هو التعبير المستويات النسبية بين المستقبلات two خيالية. للتحايل على هذه المشكلة ، يمكن للمرء أن جعل خطوط الخلية مستقرة التعبير عن كل من البروتينات في المصالح ، أو تحديد نسب الأمثل للناقلات الحمض النووي للسماح التعبير ما يعادلها. وبالمثل ، نظرا لغير موحدة ترنسفكأيشن عبر الطبق ، ونادرا ما تكون مستويات بروتين يعادل بين الخلايا. ولذلك ، يجب إيلاء الاهتمام للتمييز 'العالية' expressors من "منخفضة". تلك المستويات "متوسط" عرض من البروتين العائد عادة موثوقة وقابلة للتكرار الحنق الكفاءة. أسلوب واحد مختبرنا اتبعت للتخفيف من هذه المشكلة هو استخدام والفيروسات الغدة lenti إلى التعبير الجيني "حتى". وعلاوة على ذلك ، وهي طريقة بديلة لتبيض الصور متقبل لتحديد الكفاءة والحنق الانبعاثات توعيتهم. على الرغم من أنه على الرغم من احتمال انبعاث توعية لرصد الخلايا واحد في الوقت الحقيقي ، لقد تم العثور على الصور وتبييض متقبل أن تكون أكثر حساسية وأكثر موثوقية.

أخيرا ، يمكن أن تستخدم لرصد التفاعلات الحنق البروتين يمكن أن يكون تحديا ويتطلب الاختيار الدقيق للأطوال رابط لمستقبلات غشاء محدد. علاوة على ذلك ، إضافة C / YFP غالبا ما يؤثر بشكل كبير على مستويات بروتين تعبير وتجميع النتائج في الشبكية في هيولي باطني وجهاز جولجي. ومع ذلك ، لتفاعلات عابرة ، أو غير مستقرة ، والحنق هي المنهجية المثلى لاستخدامها.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونود أن ننوه الدكتور سكوت هندرسون للمساعدة في الفحص المجهري متحد البؤر. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ل1RO1CA127501 WAB فضلا عن تمويل المشاريع التجريبية من مركز السرطان ماسي وكلية الطب (جامعة فرجينيا كومنولث) لالميكروسكوب WAB أجريت في جامعة فرجينيا كومنولث ، دائرة. بيولوجيا الأعصاب وعلم التشريح مرفق الميكروسكوب ، دعمت ، في جزء منه ، وذلك بتمويل من مركز NIHNINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11960-069
Penicillin- Streptomycin Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum Hyclone N/A
Opti-MEM Invitrogen 11058-021
FUGENE 6 Roche Group 11814443001
Coverslip Dishes MatTek Corp. P35G014C
pcDNA3.1(+) Invitrogen V790‐20
Mach 1 Competent Cells Invitrogen C862003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
  2. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipidmodified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, 913-916 (2002).
  3. Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37, (5), 643-655 (2010).
  4. Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 80, (12), 3734-3737 (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics