פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

Published 12/26/2010
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

Cite this Article

Copy Citation

Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

היכולת לחקור באופן שיטתי בתגובה במבחנה הסלולר שילובים של גירויים mechanobiological עבור הנדסת רקמות, גילוי תרופות או בסיסי בביולוגיה מחקרים תא מוגבל על ידי טכנולוגיות bioreactor הנוכחי, אשר לא ניתן להחיל בו זמנית מגוון של גירויים מכני תאים בתרבית. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו סדרה של פלטפורמות microfabricated שנועד למסך את ההשפעות של גירויים מכניים בפורמט תפוקה גבוהה. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ובהמשך להדגים כיצד הטכנולוגיה הזאת בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית הן דו מימדי ותלת תרבות פרדיגמות ממדי.

Protocol

א תיאור התקן ותפעול

מכשירים מיוצרים באמצעות ליתוגרפיה רך multilayer 1 ב polydimethylsiloxane (PDMS), ומסוגלים לייצר בו זמנית מגוון של תנאים מכני הפרט תרבות במקומות תא פני מערך microfabricated. בפרוטוקול זה, השלבים לפברק מערך של פניאומטית-actuated microposts מתוארים הראשון, ואחריו צעדים כדי לשנות את המכשיר כדי לאפשר התרבות דינמי מכנית בשני (3D) פרדיגמות דו ממדי (2D) ו תלת ממדי התרבות. הגישה microfabricated התווה מגבירה את התפוקה על פני מערכות macroscale הקיימים, היא המתאימה ביותר עבור ההשפעה של מגוון רחב של מצבים מכניים להקרנה.

העיקרון מבצעית עבור המכשיר מבוסס על מערך של microposts actuated אנכית. Microposts מיוצרים על הסרעפת בחופשיות-מושעה, הם הרים והוריד ידי הפעלת לחצים חיוביים ושליליים מתחת לסרעפת actuation (איור 1). תכונה מרכזית של המערך היא כי על ידי שינוי גודל של הסרעפת actuation, מקור הלחץ יחיד יכול לשמש כדי להשיג מגוון רחב של התקות אנכי פני מערך. עקרון זה משמש במהירות מסך תגובה תאית למספר גדול של מצבים גירוי מכני על פני התקן יחיד.

בהתבסס על עיצוב macroscale מקביל על ידי שפר et al. 2, העיצוב שלנו כולל תרבות second מושעה משומנים תא הסרט מעל הפוסט, המאפשר לתאים לחוות עיוות המצע 2D כמו בסרט מחליק על התרבות שלאחר הטעינה העלה. לחלופין, מערך photopatterning של התא עמוס הידרוג על ההודעות הטעינה מאפשרת דחיסה של גירוי התאים בתרבית 3D. הוראות מפורטות בהקמת מערכות אלה לעקוב.

ב ייצור של המערך microactuator פנאומטי

בודה מערך microactuator פנאומטי דורש יישור מחמירים multilayer מבנים PDMS. זה מאתגר, בשל הצטמקות-Induced שגיאות יישור רישום. לכתובת זו, אנו משתמשים בתהליך ייצור כינה "עובש ייצור כריך '3, הראו ביעילות לחסל את הבעיה 4.

הכנת חומרים

  1. בודד או מרובת רמות SU-8 אדונים עבור כל אחת ברמות שונות מיוצרים cleanroom באמצעות נהלים סטנדרטיים. עבור התקנים אלה, הם אדונים 200-400 מיקרומטר עבה, בהתאם ליישום. מאסטרים הם hardbaked בשעה 80 לפני ° C במשך שלושה ימים לשימוש.
  2. שקופיות הזכוכית נקי SU-8 המאסטרים הם silanized בתא ואקום, כדי למנוע הידבקות של ריפוי PDMS לחומרים. ב fumehood, 60 μL של הסוכן silanization (tridecafluoro-1-,1,2,2 tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (ארצות כימית טכנולוגיות, בריסטול, פנסילבניה) הוא pipetted לתוך צלחת פטרי בחדר. הזכוכית חשופים SU-8 אדונים ממוקמים בחדר והמשיך תחת ואקום לילה.
  3. שתי כריות קצף (זמין בחנויות אספקת כלי שיט) ואת הסרט ממעל שקיפות דיו נחתכים למידות מעט גדול יותר אמן SU-8 המשמש עבור ייצור עובש כריך.

עובש כריך ייצור

  1. כל שכבה של המכשיר multilayer דורש שכבת PDMS יצוק באמצעות שיטה זו. סכמטי של תהליך ייצור עובש כריך מסופק באיור 1.
  2. PDMS מונומר crosslinker מעורבבים היטב ביחס 10:01 הסטנדרטי. 3 מ"ל של תערובת PDMS דפוקה מופקדים על מאסטר SU-8 מפוברק קודם לכן, degassed בתא ואקום.
  3. משטח קצף SU-8 המאסטר ממוקמים על צלחת בסיס פרספקס.
  4. שקיפות היא הורידה בזהירות אל PDMS דפוקה, מוודא כדי למנוע השמנה כל בועות האוויר. שקפים הזרקת דיו יש מחוספס וצד חלק, חשוב כי המגעים בצד להחליק את PDMS דפוקה.
  5. שקופיות הזכוכית silanized ממוקם על גבי שקיפות, מתחת כרית קצף השני צלחת העליון פרספקס. כריך הוא הידק אז יחד באמצעות C-clamp.
  6. כריך PDMS נירפאים בתנור על 80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
  7. כריך מוסר מן התנור ואפשרו להתקרר לפני הסרת מהדק.
  8. מהדק יוסר הכריך מפורקים, ואת רפידות קצף מבוטלים. שקיפות היא קילפה בזהירות מן האדון SU-8, שמירה על הסרט PDMS בדוגמת.
  9. PDMS אלה שכבות בדוגמת ושקיפות הטיפול שלהם שכבות אז יכול להיות מאוחסן בסביבה נטולת אבק, עד שהם מוכנים לשימוש. השתמשנו בהצלחה שכבות PDMS עד שני חודשים, ללא השפעות מזיקות מורגש.

בניית המכשיר multilayer

t "> סכמטית עבור ייצור של המערך microactuator מסופק 2A איור, ותפעול של מפעילים מוצג דמויות 2B ו-C כדי לפברק את המכשיר:

  1. Lowermost בדוגמת PDMS שכבת שהוכן על ידי ייצור עובש כריך. בניסויים אלו, דפוסי מעגלי החל 600 עד 1200μm בקוטר היו בשימוש.
  2. השכבה PDMS הוא הועבר לאחר מכן להחליק כוס נקייה. יחידת פריקה קורונה משמש לטיפול PDMS וזכוכית משטחים עם פלזמה חמצן, שני משטחים ממוקמים קשר אחד עם השני. מחסנית ממוקמת ואז על פלטה חמה 80 ° C כדי להשלים את תהליך מליטה. שקיפות אז יכול להיות התקלף וזנוח. במהלך תהליך זה, הסרט PDMS בדוגמת לא משתחרר מצע קשיח, מניעת הצטמקות של שכבות נפרדות.
  3. בהתאם להצלחת השלב כריך דפוס, סרטים דקים של PDMS אשר לא סחט מבין SU-8 תכונות השקיפות ייתכן שיהיה צורך להסיר. ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות מחט 25 גרם תחת stereoscope.
  4. שכבת סנדוויץ' second יצוק נוצר עובש כמו העתק השליליות של מבנה הסרעפת ו-post הרצוי. הסיבה לכך היא המצאה של שטח גדול SU-8 אדונים היא מאתגרת, אך השימוש תהליכי ייצור חלופי יכול למנוע את הצעד הנוסף. בהפגנה זו, מעגלי הודעות 500 מיקרומטר בקוטר היו בשימוש. עובש העתק שלילי silanized ו מודבקת זמנית זכוכית שקופית באמצעות דו צדדית הקלטת. דפוקה PDMS מופקד, degassed ספין מצופה על גבי שכבה זו כריך עובש למשך 45 שניות על 1000 סל"ד, מניב הסרעפת actuation 60 מיקרומטר עבה. ספין מצופה שכבת PDMS היא חלקית נרפא על 80 מעלות צלזיוס במשך ~ 20 דקות, או עד PDMS הוא דביק, אבל לא לעוות לצמיתות כאשר נגע.
  5. שקופיות הזכוכית סרט דו צדדי יוסרו מן חלקית נרפא PDMS השכבה, אשר אז פלזמה שטופלו, הפוכה והושמו aligner מחוייט. Aligner מורכב צ'אק ואקום רכוב micromanipulator (Siskiyou; המשימה Viego, קליפורניה, ארה"ב). השכבה הראשונה היא PDMS אז פלזמה שטופלו והניח על הבמה סיבובית (Newmark, מענקים Pass, או, ארה"ב), מתחת לזרוק את הריק, ויישור בין שתי שכבות הוא ציין באמצעות מכונת Navitar זום 12x חזון המערכת (Navitar; רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב).
  6. השכבות מיושרים באמצעות מניפולטור, והביא בזהירות במגע. כריך מוסר אז מן aligner, ואת נרפא בתנור על 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות. שקיפות ו silanized עובש העתק PDMS אז יכול להיות קלופים מהמכשיר וזנוח. המכשיר אז נרפא לחלוטין ב 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות.
  7. בהתאם לסוג הניסוי גירוי מכני מתנהל, שכבות נוספות PDMS אז יכול להיות קשור למכשיר זה הבסיס על ידי חזרה על התהליך המתואר. פרטים עבור סוגים שונים של ניסויים גירוי מכני ניתנים סעיפים C ו-D

מחברים

  1. לאחר התקן הושלמה, מחט ניתן להשתמש כדי לנקות את השכבה PDMS בנקודת החיבור.
  2. מחברים מסחרי כגון Nanoport (אפצ'רץ' מדעי; Oak Harbor, וושינגטון, ארה"ב) לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להתממשק עם צינור חיצוני. כדי למנוע את דרישות שיא מחברים מסחרי, ובכך להשתמש בצלחות פטרי סטנדרטי כמו מכולות המכשיר, אנו לפברק שלנו כדלקמן.
  3. כ 35 גרם של PDMS הוא יצוק נרפא במגש Omni-היטב (Nunc, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב). המכשיר הוא מקולף, לחתוך לפרוסות אטם קטן, שממנו 1 / 8 "חור מוסר באמצעות אגרוף.
  4. מחט קהה 18G משמש הליבה החוצה קטע מהצד של אטם. מחט 21G קטן משמש כדי להסיר את הליבה המרכזית לפני משיכת מחט 18G.
  5. 15g של כ PDMS הוא יצוק נרפא במכסה Omni-גם מגש, קלופים וחתוכים לתוך קטע בגודל דומה. סעיף זה הוא ניקה ואז עם נייר דבק, פלזמה ערובה לחלק העליון של אטם, ואת היחידה היא פלזמה קשור למכשיר, הצד אגרוף למטה.
  6. מחט שנייה 18G בוטה מופרד אז מהמחבר פלסטיק צבעוניים luer, מוכנס לתוך החור cored וחתום במקום עם כמה טיפות של PDMS. מחבר וכתוצאה מכך הוא די יעיל, חסכוני ובעל נפח מת מרחב גדול מספיק כדי למנוע בועות אוויר מלהיכנס ערוצי בשלבי מילוי נוזלי.

ג פעיל מבחינה מכנית תרבות מצעים 2D

מערך של microposts actuated ניתן להשתמש כדי ליצור פרופילים שונים המתח בסרט פולימר מושעה, שבו תאים בתרבית. העלאת פוסט לסרט משומנים גורם סרט להחליק לעוות סביב העמוד. השימוש לפרסם תוצאות מעגלי טעינה בחלוקת זן equibiaxial, אבלהעיצוב הוא צדדי כי צורות שונות לכתוב יכול לשמש כדי ליצור מגוון של שדות זן. כדי לשנות את מערך מפעיל ניסויים תרבות 2D (סכמטי באיור 3):

  1. בונד השכבה השלישית PDMS למכשיר, כפי שמוצג באיור 3 א. השכבה השלישית מורכבת PDMS מבנה דו שכבה. המעגל התחתון מתאים לגודל של חלל actuation מתחת microposts actuated. הקוטר של העיגול העליון הוא 100μm גדול יותר בקוטר של ההודעות הטעינה. 200 מיקרומטר microchannel רחב מתחבר תכונות אלה באזור החיבור, ישמש לשמן את ההודעות העמסה סרט תרבות.
  2. לפברק ומחברים הקשר למכשיר, כפי שתואר לעיל.
  3. מעיל ספין 10-15 מיקרומטר שכבה עבה של PDMS על הצד החלק של שקיפות (פרמטרים ספין: 4000 סל"ד, 120 שניות). Cure על 80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות.
  4. אפי ואקום ברמה נמוכה (Barnant שאיפה האוויר משאבת לקצינים) של מפעילים, הורדת מערך של ההודעות.
  5. פלזמה לטיפול האג"ח הסרט מצופה ספין PDMS כדי microdevice actuated. מניחים על פלטה חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ההודעות וקולנוע תרבות יישאר הידרופילי לזמן קצר.
  6. מלאו את ערוצי סיכה עם גליצרול 90% בפתרון מים deionized. בנוסף שימון, ניסוח זה שומר על hydrophilicity של PDMS ללא הגבלת זמן, צמצום מקדמי חיכוך. בועות האוויר יישארו לכודים בין לפרסם את הסרט התרבות. מניחים את המכשיר על פלטה חמה ב 40 ° C, ולהמשיך להזריק חומר סיכה לתוך התעלה, גורם לעליה בלחץ קטן. אחרי כמה דקות, את בועות האוויר יהיה מפוזר דרך PDMS, וכל המשטחים יהיו משומנים.
  7. הסר את הלחץ השלילי, משחררים את ההודעות.
  8. באמצעות אזמל, חתך סביב הסרט PDMS דק. בזהירות מקלפים את השקיפות להתרחק מן המכשיר.
  9. פלזמה האג"ח יד לחתוך PDMS אטם מסביב לאזור תרבות המכשיר.
  10. לעקר את המכשיר על ידי השריית באתנול 70% במשך 5 דקות, ולאחר מכן, תחת אור UV קוטל חידקים בארון בטיחות ביולוגית במשך 45 דקות.
  11. פלזמה לטפל משטח דגירה עם קולגן מיקרוגרם / ml 100 (או חלופה חלבון ECM) לילה ב 4 ° C.
  12. לשטוף את המכשיר עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), ותאי הזרע בבית 10-15000 תאים / 2 ס"מ, לאחר פרוטוקולים סטנדרטיים התרבות התא.

אפיון מפורט של המבצע microdevice ניסויים ביולוגיים שנערכו על פלטפורמה זו פורסמו במקומות אחרים 7.

ד פעילה מבחינה מכנית 3D הידרוג

שינויים אל המכשיר יכול לשמש גם כדי לאפשר דחיסה של photopatterned. תא עמוס, תלת מימדי הידרוג באופן תפוקה גבוהה. בדוגמה זו, אנו יוצרים בקוטר 350 מיקרומטר פוליאתילן גליקול (PEG) צילינדרים הידרוג'ל, encapsulating C3H10T1 / 2 mesenchymal עכבר לתאי גזע, ולהחיל זנים דחיסה הנעים בין 5 ל 25% על פני המערך. פרוטוקול זה יכול לשמש עם יותר chemistries photopolymerization מתקדמים הידרוג'ל. כדי להשתמש במה ניסויים mechanobiology תלת ממדי (סכמטי באיור 4):

התקן שינויים:

  1. מעיל את ההודעות עם שכבה 1 מיקרומטר עבה של Parylene-C כדי להפחית את חדירות גז ולשפר פעמים פילמור במערכת הידרוג PEG. זה יקטין את השפעות ציטוטוקסיות התגובה הקיצונית מבוססי חינם photopolymerization. חתיכות של נייר דבק משמשות כדי להסוות את האזורים סביב העמוד, ואת המכשיר מצופה מערכת 2010 PDS 2 LabCoter (ציפוי מערכות מיוחדים: אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב).
  2. המכשיר מצופה מוסר ממערכת ציפוי, ואת נייר דבק התקלף, משאיר שכבה קונפורמי של C-Parylene על ההודעות.
  3. Coverslip זכוכית methacrylated 8 על ידי טבילה בתמיסת v / v 2% - 3 (trimethoxysilyl) methacrylate propyl באתנול 95% למשך 2 דקות.
  4. Coverslip היא שטפה באתנול 100%, אפויה ב 100 ° C, עוזב קבוצות methacrylate על פני השטח.
  5. 200 מיקרומטר עבה הסרט PDMS spacer הוא יצוק בצלחת פטרי, וחותכים למקטעים קטנים. ארבעה מהסעיפים האלה קטנים פלזמה מלוכדות סביב קצה coverslip methacrylated.
  6. מפרידי הם אז פלזמה קשור תחומים PDMS של המכשיר, המכסה את Parylene-C ההודעות מצופה.
  7. מכשיר מעוקר ידי שטיפה באתנול 70%, ואת החשיפה לאור UV קוטל חידקים בארון בטיחות ביולוגית במשך 45 דקות.

ב פילמור באתרו:

Cell עמוס הידרוג PEG היו אז בדוגמת photolithographically לתוך המכשירים 8,9 כדלקמן:

  1. הכן 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan ביו; הערבי, אל על, ארה"ב) ו - 10% w / v PEG (8kDa, סיגמא אולדריץ)פתרון בתקשורת תרבות unsupplmented התא.
  2. הכינו מלאי photoinitiator פתרון של 100 מ"ג / מ"ל ​​של Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, ניו יורק, ארה"ב) ב 1-ויניל-2-pyrolidinone.
  3. ביסודיות לערבב את שני פתרונות מוכנים ביחד כדי להשיג פתרון עם ריכוז של 0.4% w / v של photoinitiator. סנן את התערובת דרך מסנן 0.45 מזרק מיקרומטר לעקר ולהוציא חלקיקים.
  4. Trypsinize בתרביות תאים ולהכין ההשעיה תא התקשורת והתרבות, בשעה פעמיים ריכוז נקודת הסיום הרצוי התא.
  5. מערבבים את ההשעיה התא המסוננת מבשר / photoinitiator פתרון הידרוג על יחס 01:01.
  6. להזריק את התמיסה לתוך microdevice באמצעות מחט 25 גרם זמן. בזהירות למנוע השמנה בועות המכשיר.
  7. יישור מסכת השקיפות מודפס סימני יישור על פני השטח את המכשיר. הגדרת מערכת תאורה UV לספק מנה UV של 17.5 mW / 2 ס"מ על פני השטח את המכשיר. להאיר את הידרוג דרך המסכה עבור 195 s. הפעם כבר מותאם למערכת שלנו, ייתכן שיהיה צורך להתאים.
  8. לשטוף unpolymerized מבשר פתרון הידרוג'ל עם PBS, ולהחליף את PBS עם התקשורת והתרבות. להניע את ההודעות טעינת כדי לדחוס את בונה הידרוג'ל.

אפיון מפורט של המבצע microdevice ניסויים ביולוגיים שנערכו על פלטפורמה זו פורסמו 10 במקום אחר.

א ציוד היקפי

השתנה בצלחות פטרי משמשים כדי לשמור על סטריליות של תרביות תאים במהלך actuation של המכשירים. מחט 18G הקהה והסיר הוא epoxied לתוך חור קדח בצד של צלחת פטרי. Tubing (קליי אדמס Intramedic PE190; VWR הבינלאומי, ארלינגטון הייטס, אילינוי, ארה"ב) הוא לחץ, מצויד אלה מחברים מתחבר שסתומים סולנואיד מבוקרת מקור הלחץ.

הלחצים המכשירים מסופקים על ידי micropumps חיצוני. עבור ניסויים 2D, ערכי לחץ חיובי של 30-55 kPa נוצרו באמצעות משאבת מתח שבשליטת הסרעפת אקסצנטרי (SP 500 EC-LC 4.5VDC; שוורצר Precision, גרמניה). הדופק רוחב בקר מבוסס אפנון מתח משמש לשנות את מתח להחיל בקרת פלט הלחץ. שסתומים סולנואיד ואת יריעות (S10MM-30-12-3 ו MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, ארה"ב) משמשים כדי ליצור צורת גל הלחץ מחזורית. שסתומים הם actuated עם האות V 12, נשלט על ידי מחולל צורת גל מרובע לתפקד.

פ אפיון ההתקנים להשתמש

הדמיה במכשיר

בעיה נפוצה עם תאים הדמיה או חלקיקים על המכשיר רזולוציה אופטית עניים עקב התעבות של טיפות מתחת הסרט PDMS לתמוך בהודעה הטעינה. התעבות זו נובעת מהפרשי טמפרטורה ולחות בתוך החממה לאחר קיבוע או על הבמה מיקרוסקופ. כדי לפתור בעיה זו:

  1. חבר המאגר פתוח לנמל כניסת לחץ, ממלאים אותה במים deionized. אנחנו משתמשים במזרק פתוח עם מחבר לנעול luer לנוחות.
  2. מניחים את המכשיר מאגר מלא בתא ואקום, משאבת למטה.
  3. המתן 5 דקות, ולהביא את תא הלחץ האטמוספרי. חזור פעמיים או שלוש פעמים. כמו אוויר העקורים מתוך הערוצים של המכשיר, היא מוחלפת עם מים מן המאגר, ביטול ותרכיזים אגל ומתן נתיב ברור עבור מיקרוסקופיה אופטית.
  4. תרבות תמונה אזורים באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

עבור הדמיה תא חי, הליך זה יכול להתבצע לפני זריעת התאים על המכשירים. עם זאת, חייב להיות מתוכנן ערוצי גדול מספיק כדי למנוע הפסדים צמיג הלחץ בין יחידות במכשיר.

אפיון מסננים על ידי מעקב אחר חרוז

על מערכות תרבות 2D:

  1. מדולל 1 מיקרומטר קוטר חרוזי ניאון (בנגס מעבדות; פישר, IN) ב מתנול לריכוז הרצוי. דילולים של 1:150 מתוך ריכוזי המקורי (מוצקים 1% פתרון חיץ חרוז) נמצאו מתאימים לצרכים שלנו.
  2. פלזמה לטפל משטח המכשיר, להפקיד μL 5-10 ההשעיה חרוז.
  3. חכו מתנול להתאדות. חזור אם חרוז ריכוז נמוך מדי.
  4. תמונה התא תחומי התרבות במנוחה, ותחת עומס.
  5. קוד פתוח אוטומטיות מעקב אלגוריתמים החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש ב ImageJ (NIH) כדי לעקוב אחר התקות חרוז.
  6. פרמטרים של גודל עקירה, כיוון ומיקום לאחר מכן ניתן להשתמש במודל מתמטי כדי לאפיין שדות המתח על פני השטח את המכשיר.

הליך דומה ניתן לאפיין בעקבות זנים במערכות 3D. מערבבים כמות של חרוזים פלורסנט אל hמבשר ydrogel פתרון. במקרה של מערכת הידרוג PEG, גודל הנקבוביות הם הרבה יותר קטנים מאלה של חרוזים בקוטר 1 מיקרומטר. חרוזים הם הגלום הידרוג, ומערכת ניתן הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal. התקות ביד אז יכול להיות במעקב, מנותח מצויד מודל העיוות.

ג נציג תוצאות

תוצאות נציג עבור ייצור המכשיר, אפיון ותפעול ניתנים תרשימים 5 ו -6.

איור 1
באיור 1. עובש סנדוויץ תהליך הייצור. (א) שקיפות ממעל הוא הוריד בזהירות על המאסטר SU-8 על PDMS דפוקה. (ב) כריך ממוקם מחסנית, קצף זכוכית ומתכת, ואת נרפא בתנור תחת דחיסה. (ג) מחסנית היא מפורקים השקיפות התקלף, שמירה על PDMS בדוגמת שכבה 3. לשכפל על ידי רשות של המכון לפיסיקה.

איור 2
איור 2. סכמטי של micropost actuated אנכית במנוחה (א) ו - (ב) כאשר actuated. (ג) סכמטי של תהליך ייצור multilayer הנדרש כדי להפוך את מערך microposts 3. המעובד על ידי רשות של המכון לפיסיקה.

איור 3
איור 3. תהליך שינוי מערך microactuator לבצע ניסויים על תאים בתרבית על מצע דו מימדי לעוות 7. לשכפל על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

איור 4
איור 4. תהליך שינוי מערך microactuator לבצע ניסויים על תאים בתרבית הידרוג תלת ממדי photopatterned בונה 10. לשחזרו ברשות Elsevier.

איור 5
איור 5. (א) מכשיר מדגם לתרבות mechanostimulatory 2D. הצבע האדום משמש לציון משלוח actuating לחץ הערוצים, ואת הצבע הכחול משמש כדי לסמן את ערוצי שימון. (ב) לדוגמה תמונה של ניסוי אפיון זן. כתמים אדומים מייצגים את המיקום undeformed של חרוזים, בעוד כתמים ירוקים מייצגים את מיקומי מעוות 7. לשכפל על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

איור 6
איור 6. (א) מכשיר מדגם ניסויים דחיסה 3D. צבע ירוק המשמש לציון ערוצי actuation הלחץ. (ב) מלמעלה למטה תצוגה של מערך micropost עם (ג) הידרוג לבנות בדוגמת על גבי העמוד. (D, E) Side-משוחזר תמונות של חרוזי ניאון הידרוג לבנות תחת היתר (ד) ו - (ה) לחצים actuation 55 kPa, הממחיש את תהליך אפיון זן במערכת התרבות 3D 10. לשחזרו ברשות Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות פשוטה מבחינה מושגית, ייצור המכשיר לוקח כמה מיומנות בפועל ניסיוניים. במיוחד במקרה של תרבית תאים 2D, יישור של שכבות מרובות של המכשיר יכול להיות מאתגרת, במיוחד על מערך גדול באזור. למעשה, אנחנו יכולים להשיג הצלחה אמינה 100% מערך שיעור באמצעות מכשירים עם 50 מיקרומטר הסובלנות המרווח בין תכונות סמוכים שכבות מרובות. יש לנו גם הפגינו בהצלחה בקנה אחד עם טולרנסים נמוך כמו 15 מיקרומטר, אך הפעם יישור הנדרשת היא באופן משמעותי יותר מושגת בשיעור הצלחה נמוך יותר. המערך של המסכה על biomaterials photopattern על מערך דומה היא מאתגרת, אבל את ההודעות יכול להיות מתוכנן להיות גדול למדי בהשוואה צילינדרים הידרוג'ל, להקל זה אילוץ.

אתגרים אחרים לערב תרבית תאים על החומרים המתוארים בפרוטוקול זה. במערכת מתיחה 2D, באמצעות PDMS כמו סרט תרבות גבולות החקירה הביולוגית לטווח קצר ניסויים, כמו הידבקות התא למצע מתחיל להיות מושפע באופן משמעותי לאחר 6 שעות של גירוי. זה ניתן לתקן על ידי קוולנטית חלבונים מטריצה ​​מחייב את פני השטח PDMS 11, או על ידי החלפת מצע תרבות PDMS התא עם חומר פוליאוריטן יותר רלוונטי מבחינה קלינית, כדי לשפר את הידבקות התא ולספק גמישות רבה יותר ניסויים ביולוגיים נערכו 12. במערכת 3D תיאר, הכימיה הידרוג מיועד כדוגמה המחשה בלבד. לטווח ארוך התרבות של תאים חסיד מחייב שימוש הידרוג טבעיים או סינתטיים חלופיים, או הכללת ligands דבק לתוך המטריצה ​​PEG (אשר יכולה להיות מושגת בקלות באמצעות chemistries PEGylation רגיל) 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

אנו מכירים תמיכה כספית למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה המכון הקנדי לבריאות מחקר (CHRPJ 323533-06), תוכנית מלגות לתארים מתקדמים אונטריו ל CM, ואת המחקר כיסאות קנדה מיקרו וננו הנדסת מערכות אל י"ש, וגם Mechanobiology כדי CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  2. Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
  3. Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
  5. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  6. Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
  7. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
  8. Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
  9. Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  10. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
  11. Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
  12. Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
  13. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats