Mikrofabricerade Plattformar för Mekaniskt Dynamic Cell Culture

Published 12/26/2010
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

I detta protokoll visar vi tillverkning av en microactuator rad vertikalt fördrivna inlägg som tekniken bygger, och hur denna bas tekniken kan modifieras att bedriva hög kapacitet mekaniskt dynamic cellodling i både tvådimensionell och tredimensionell kultur paradigm.

Cite this Article

Copy Citation

Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Möjligheten att systematiskt sond in vitro cellulära svar på kombinationer av mechanobiological stimuli för tissue engineering, läkemedelsutveckling eller grundläggande cellförsök biologi begränsas av nuvarande bioreaktor teknik, som inte kan samtidigt använda en mängd olika mekaniska stimuli till odlade celler. För att åtgärda detta har vi utvecklat en serie mikrofabricerade plattformar för att skärmen för effekterna av mekaniska stimuli i en hög genomströmning format. I detta protokoll visar vi tillverkning av en microactuator rad vertikalt fördrivna inlägg som tekniken bygger, och därutöver påvisa hur denna bas teknik kan ändras för att bedriva hög kapacitet mekaniskt dynamisk cellodling i både två-dimensionella och tre- dimensionell kultur paradigm.

Protocol

A. Enhet beskrivning och funktion

Enheter tillverkas med hjälp av flera lager mjuk litografi 1 i Polydimetylsiloxan (PDMS), och samtidigt kunna generera en rad mekaniska förhållanden på individuella platser cellkultur över mikrofabricerade matrisen. I detta protokoll är stegen för att tillverka en rad pneumatiskt manövrerad microposts först beskrevs, följt av åtgärder för att modifiera enheten så att mekaniskt dynamisk kultur i både två-dimensionella (2D) och tredimensionella (3D) kultur paradigm. Den beskrivs mikrofabricerade metoden ökar genomströmningen över befintliga makroskala system, och passar bäst för screening för effekterna av en mängd olika mekaniska förhållanden.

Den operativa principen för enheten är baserad på en rad vertikalt aktiveras microposts. Microposts är monterad på ett fritt svävande membran, och höjs och sänks med hjälp av positiva och negativa trycket under igångsättning membranet (Figur 1). En viktig egenskap hos matrisen är att genom att variera storleken på aktivering membran kan ett enda tryck källa användas för att få en rad av vertikala förskjutningar över matrisen. Denna princip används för att snabbt skärmen cellulära svar på ett stort antal mekaniska stimulerande förhållanden över en enda enhet.

Baserat på en liknande makroskala design av Schaffer et al. 2, innehåller vår design en andra stängts och smörjas film cellodling över posten, vilket gör att cellerna att uppleva 2D-substrat deformation som glider kulturen filmen över den upphöjda lastning inlägget. Alternativt kan photopatterning en rad cell-lastad hydrogeler över lastning tjänsterna för tryckspänning stimulering av celler i 3D kultur. Detaljerade instruktioner för att inrätta dessa system följer.

B. Tillverkning av pneumatiska microactuator rad

Tillverkning arrayen pneumatiska microactuator förutsätter strikta anpassningen i flera lager PDMS strukturer. Detta är en utmaning, på grund av krympning-inducerad fel anpassning registrering. För att lösa detta använder vi en tillverkningsprocessen kallas "sandwich mögel tillverkning" 3, visat sig effektivt eliminera denna fråga 4.

Material Förberedelser

  1. Single-eller multi-level SU-8 mästare för alla de olika nivåerna tillverkas i renrum med vanliga procedurer. För dessa enheter mästare 200-400 ìm tjocka, beroende på applikation. Masters är hardbaked vid 80 ° C under tre dagar före användning.
  2. Rengör glas diabilder och SU-8 mästare silaniseras i en vakuumkammare, för att förhindra vidhäftning att bota PDMS till materialet. I en fumehood är 60 mikroliter av silaniseringen agent (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-Trichlorosilane (Förenade Chemical Technologies, Bristol, PA) pipetteras i en petriskål i kammaren. Den nakna glas och SU-8 mästare placeras i kammaren och förvaras under vakuum över natten.
  3. Två skumkuddar (finns i butiker hantverk utbudet) och en överliggande Inkjet OH-film klipps till storlekar som något större än SU-8 mästare används för smörgås mögel tillverkning.

Sandwich Mögel Fabrication

  1. Varje lager av flera lager enheten kräver en PDMS lager gjuten med denna metod. En schematisk av sandwich mögel tillverkningsprocessen ges i figur 1.
  2. PDMS monomer och crosslinker blandas väl i standarden 10:01 förhållandet. 3 mL ohärdad PDMS blandning deponeras på en tidigare fabricerade SU-8 herre, och avgasade i en vakuumkammare.
  3. Skummet pad och SU-8 mästare placeras på ett plexiglas bottenplatta.
  4. Öppenheten är noga sänks ned på ohärdade PDMS och se till att stänga några luftbubblor. Inkjet OH-film har en grov och en slät sida, och det är viktigt att den släta sidan kontakt med ohärdade PDMS.
  5. En silaniserad glasskiva placeras på toppen av öppenhet, under den andra skum pad och ett plexiglas topplattan. Smörgåsen är då spänns ihop med en C-klämman.
  6. Den PDMS sandwich är härdad i ugn vid 80 ° C under minst 4 timmar.
  7. Smörgåsen tas bort från ugnen och svalna innan du tar bort klämman.
  8. Klämman tas bort och smörgås demonteras, och skummet kuddar kasseras. Öppenheten är omsorgsfullt skalade bort från SU-8 herre, behålla mönstrade PDMS filmen.
  9. Dessa mönstrade PDMS lager och deras hantering lager öppenhet kan sedan lagras i en dammfri miljö tills de är redo för användning. Vi har framgångsrikt använt PDMS skikt upp till två månader gamla, utan några märkbara skadliga effekter.

Konstruera flerskiktade enhet

t "är> Den schematiska för tillverkning av microactuator rad i figur 2A, och drift av ställdon visas i figur 2B och C. För att tillverka enheten:

  1. Den nedersta mönstrade PDMS lagret är utarbetad av smörgås mögel tillverkning. För dessa experiment var cirkulära mönster som sträcker sig från 600 till 1200μm i diameter används.
  2. Den PDMS lagret överförs därefter till en ren glasskiva. En coronaurladdning Enheten används för att behandla PDMS och glasytorna med syre plasma, och de två ytorna är i kontakt med varandra. Bunten placeras sedan på en värmeplatta vid 80 ° C för att slutföra bindning processen. Öppenheten kan sedan skalas bort och kasseras. Under denna process är det mönstrade PDMS filmen aldrig utsläppt från ett stelt substrat, förhindrar krympning av enskilda lager.
  3. Beroende på framgången med smörgås gjutning steg tunna filmer av PDMS som inte har pressats ut från mellan SU-8 funktioner och öppenheten kan behöva tas bort. Detta kan göras manuellt med en 25G nål i en stereoskop.
  4. Den andra smörgås formade skikt bildas som en negativ kopia form av önskad membran-och-efter struktur. Detta beror på tillverkning av stora ytor SU-8 Masters är utmanande, men användningen av alternativa tillverkningsprocesser kan eliminera detta extra steg. I denna demonstration var rund inlägg 500 mikrometer i diameter används. Den negativa replik mögel är silaniseras och tillfälligt fästas på en glasskiva med hjälp av dubbelhäftande tejp. Ohärdad PDMS deponeras, avgasade och spin-belagd till denna smörgås mögel skikt i 45 sekunder vid 1000 rpm, vilket ger en aktivering diafragman 60 ìm tjock. Den spin-belagd PDMS skikt är delvis härdad vid 80 ° C ~ 20 minuter, eller tills PDMS är klibbig men inte deformeras permanent vid beröring.
  5. Den glasplatta och dubbelhäftande tejp tas bort från delvis härdade PDMS skikt, som sedan plasma-behandlade, inverterad och placeras i en skräddarsydd Aligner. Den Aligner består av ett vakuum chuck monterad på en mikromanipulator (Siskiyou, Mission Viego, CA, USA). Den första PDMS skiktet är sedan plasma-behandlade och placeras på en roterande scenen (Newmark, Grants Pass, OR, USA), under vakuum chuck och justering mellan de två skikten observeras med hjälp av en Navitar 12x zoom systemet vision (Navitar; Rochester, NY, USA).
  6. Lagren är i linje med roboten och noggrant kommer i kontakt. Smörgåsen tas sedan bort från Aligner, och härdas i ugn vid 80 ° C i ytterligare 30 minuter. Öppenheten och silaniserad replik PDMS mögel kan sedan skalas från enheten och kasseras. Enheten är sedan helt botad vid 80 ° C i minst fyra timmar.
  7. Beroende på vilken typ av mekanisk stimulering experiment utförs, kan ytterligare PDMS lager då bundna till denna bas enhet genom att upprepa beskrivs processen. Detaljer för olika typer av mekanisk stimulering experiment finns i avsnitten C och D.

Anslutningar

  1. När enheten är klar, kan en nål användas för att rensa PDMS lagret vid tidpunkten för anslutningen.
  2. Kommersiella kontakter som Nanoport (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA) kan sedan användas för att kommunicera med externa slangar. För att undvika höjd kraven från kommersiell kontakter, och därmed använda vanliga petriskålar som enhet behållare, fabricera vi vår egen enligt följande.
  3. Cirka 35 g av PDMS är gjuten och härdas i en omni-och facket (Nunc, Rochester, NY, USA). Enheten är skalade och skurna i små packningen sektioner, där en 1 / 8 "hål bort med en punch.
  4. En 18G slö nål används för att kärna ur en sektion från sidan av packningen. En mindre 21G nål används för att ta bort den centrala kärnan innan dra tillbaka 18G nål.
  5. Cirka 15 g av PDMS är gjuten och härdas i en omni-och fack lock, skalade och skurna i liknande storlek avsnitt. Detta avsnitt är sedan rengöras med Scotch tejp, plasma bundna till toppen av packningen, och enheten är plasma bundet till enheten, stansade nedåt.
  6. En andra trubbiga 18G nål separeras sedan från färgad plast luerfattningen, instoppat i fyllda hålet och förseglas på plats med några droppar PDMS. Den resulterande kontakten är ganska effektiv, ekonomisk och har en död-utrymme volymen tillräckligt stor för att förhindra att luftbubblor kommer in i kanalerna under flytande fyllning stadier.

C. Mekaniskt aktiva 2D kultur substrat

Den samling av aktiverade microposts kan användas för att skapa olika påfrestningar profiler i en svävande polymerfilm, som cellerna odlas. Att höja inlägg i en smord film gör filmen till halka och deformera runt inlägget. Med hjälp av en cirkelformad resultat om du fyller tjänst vid en equibiaxial stam distribution, menDesignen är mångsidig i att olika inlägg former kan användas för att skapa en rad olika påfrestningar fält. För att ändra ställdonet arrayen för 2D kultur experiment (schematiskt i figur 3):

  1. Bond tredjedel PDMS lager till enheten som visas i figur 3a. Den tredje PDMS skiktet består av två lager struktur. Ju lägre cirkeln matchar storleken på aktivering hålrummet under aktiveras microposts. Diametern av den övre cirkeln är 100μm större än diametern på lastning inlägg. Ett 200 ìm brett mikrokanalplatta ansluter dessa funktioner till en anslutning område, och kommer att användas för att smörja lastning inlägg och kultur film.
  2. Tillverka och obligationer anslutningar till enheten, som tidigare beskrivits.
  3. Spin päls en 10-15 ìm tjockt lager av PDMS på den släta sidan av en öppenhet (spinn parametrar: 4000 RPM, 120 sekunder). Cure vid 80 ° C under minst 4 timmar.
  4. Appy en låg nivå vakuum (Barnant Air Cadet strävan pump) till ställdon, sänka utbud av tjänster.
  5. Plasma behandla och obligationer spin belagda PDMS film till aktiverade microdevice. Placera på en värmeplatta vid 80 ° C i 10 minuter. Stolparna och kultur filmen kommer att vara hydrofil för en kort tid.
  6. Fyll smörjning kanaler med en 90% glycerol i avjoniserat vatten lösning. Förutom smörjning, har skapat denna formulering hydrofila av PDMS på obestämd tid, vilket minskar friktionen koefficienter. Luftbubblor förblir fångade mellan posten och kultur film. Placera enheten på en värmeplatta vid 40 ° C, och fortsätter att injicera smörjmedel in i kanalen, vilket orsakar en liten tryckökning. Efter några minuter kommer luftbubblorna diffusa genom PDMS, och alla ytor ska smörjas.
  7. Ta bort det negativa trycket släpper inlägg.
  8. Med hjälp av en skalpell, skär runt den tunna PDMS filmen. Dra försiktigt insyn stöd från enheten.
  9. Plasma bond en hand-cut PDMS packningen runt enheten kultur området.
  10. Sterilisera apparaten genom att blötlägga i 70% etanol i 5 minuter, och sedan under en bakteriedödande UV-ljus i ett biologiskt säkerhetsskåp i 45 minuter.
  11. Plasma behandla ytan och inkubera med 100 mikrogram / ml kollagen (eller alternativa ECM protein) över natten vid 4 ° C.
  12. Tvätta enheten med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och celler frö på 10-15.000 celler / cm 2, enligt standardprotokoll cellkultur.

Detaljerad beskrivning av microdevice drift och biologiska experiment som utförs på denna plattform har publicerats någon annanstans 7.

D. Mekaniskt aktiva 3D-hydrogel

Ändringar till enheten kan också användas för att aktivera komprimering av photopatterned. cell-lastade, tredimensionell hydrogeler i en hög genomströmning sätt. I detta exempel skapar vi 350 ìm diameter polyetylenglykol (PEG) hydrogel cylindrar, kapsla in C3H10T1 / 2 mus mesenkymala stamceller, och tillämpa tryckkrafter stammar från 5 till 25% över hela matrisen. Detta protokoll kan användas med mer avancerade kemier hydrogel photopolymerization. För att använda en plattform för experiment i tredimensionella mechanobiology (schematiskt i Figur 4):

Enhet ändringar:

  1. Belägga inlägg med ett 1 mm tjockt lager av Parylen-C för att minska gaspermeabilitet och förbättra polymerisation gånger i PEG hydrogelen systemet. Detta kommer att minska de cytotoxiska effekterna av fria radikaler-baserade photopolymerization reaktion. Bitar av tejp används för att maskera områdena kring tjänsten, och enheten är överdragna med en PDS 2010 LabCoter 2-systemet (Specialty Coating Systems, Indianapolis, IN, USA).
  2. Den belagda enheten tas bort från beläggningen systemet och tejp skalade bort, vilket lämnar en konforma lager av Parylen-C över inlägg.
  3. Ett glas täckglas är methacrylated 8 genom nedsänkning i en 2% v / v lösning av 3 - (trimethoxysilyl) propyl metakrylat i 95% etanol i 2 minuter.
  4. Den täckglas sköljs i 100% etanol, och bakas i 100 ° C, vilket metakrylat grupper på ytan.
  5. En 200 ìm tjock PDMS spacer filmen är gjuten i en petriskål, och skär i små sektioner. Fyra av dessa små sektioner plasma bundna runt kanten av methacrylated täckglas.
  6. Spacers är då plasma bundna till PDMS-områden i enheten, som omfattar Parylen-C belagda inlägg.
  7. Enheten är steriliserad genom att tvätta i 70% etanol, och exponering för bakteriedödande UV-ljus i ett biologiskt säkerhetsskåp i 45 minuter.

In situ polymerisation:

Cell-lastad PEG hydrogeler har sedan photolithographically mönstrade in enheterna 8,9 enligt följande:

  1. Förbered en 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio, arabiska, AL, USA) och 10% w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)lösning i unsupplmented media cellkultur.
  2. Bered en lösning fotoinitiator lager av 100 mg / ml Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, USA) i 1-vinyl-2-pyrolidinone.
  3. Blanda två förberedda lösningar tillsammans för att erhålla en lösning med en koncentration av 0,4% w / v av fotoinitiator. Filtrera blandningen genom ett 0,45 ìm sprutfilter att sterilisera och ta bort partiklar.
  4. Trypsinize cellkulturer och förbereda en cellsuspensionen i kulturmedia dubbelt önskade slutpunkten cellkoncentrationen.
  5. Blanda cellsuspension och den filtrerade hydrogelen föregångare / fotoinitiator lösning i förhållandet 1:1.
  6. Injicera lösningen i microdevice med hjälp av en lång 25G nål. Försiktigt undvika fånga bubblor i enheten.
  7. Rikta en tryckt öppenhet mask för anpassning märken på enheten ytan. Inrätta ett UV-belysning för att ge en UV-dos på 17,5 mW / cm 2 vid enheten ytan. Belysa hydrogelen genom masken för 195 S. Den här gången har optimerats för vårt system, och kan behöva justeras.
  8. Tvätta bort Opolymeriserat lösning hydrogel föregångare med PBS, och ersätta PBS med kulturen medier. Aktivera lastning inlägg att komprimera hydrogelen konstruktioner.

Detaljerad beskrivning av microdevice drift och biologiska experiment som utförs på denna plattform har publicerats någon annanstans 10.

E. Kringutrustning

Ändrad petriskålar används för att upprätthålla sterilitet av cellkulturer vid aktivering av enheterna. En slö och strippad 18G nål epoxied i ett hål som borrats i sidan av petriskål. Slangar (Clay Adams Intramedic PE190, VWR International, Arlington Heights, IL, USA) är tryck-som sitter på dessa kontakter och ansluter till den kontrollerade magnetventiler och tryck källa.

Trycket på att enheterna tillhandahålls av externa micropumps. För 2D-experiment, var positiva trycket värden från 30 till 55 kPa genereras med hjälp av en spänning kontrollerad excentriska membranpump (SP 500 EG-LC 4.5VDC, Schwarzer Precision, Tyskland). En pulsbreddsmodulering baserade spänning regulatorn användas för att variera spänningen att kontrollera trycket utgången. Magnetventiler och fördelare (S10MM-30-12-3 och MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) används för att skapa en cyklisk press vågform. Ventilerna manövreras med en 12 V-signal, som styrs av en kvadrat vågform funktion generator.

F. enhet karakterisering och användning

Imaging på enheten

Ett vanligt problem med bildbehandling celler eller partiklar på enheten är dålig optisk upplösning på grund av kondens av droppar under PDMS filmen stödja lastning inlägget. Denna kondensation uppstår temperatur och luftfuktighet skillnader inne i inkubatorn och efter fixering eller på ett mikroskop scenen. Så här löser du problemet:

  1. Anslut en öppen behållare till trycket inloppet, och fyll den med avjoniserat vatten. Vi använder oss av en öppen spruta med luer-lock anslutning för bekvämlighet.
  2. Placera enheten och fylld reservoar i en vakuumkammare och pumpar ner.
  3. Vänta 5 minuter och ta kammaren till atmosfärstryck. Upprepa två eller tre gånger. Eftersom luften är fördrivna ur kanalerna i enheten är den ersättas med vatten från reservoaren, vilket eliminerar droppen kondenserar och ger en tydlig optisk väg för mikroskopi.
  4. Bild kultur områden med ljusa fält eller fluorescensmikroskopi.

För levande cell imaging, kan förfarandet ske före sådd cellerna i enheter. Däremot måste kanalerna vara utformade tillräckligt stor för att förhindra viskösa förluster av tryck mellan enheter på enheten.

Karaktärisering av isolat av pärla spårning

På 2D-kultur-system:

  1. Späd 1 mikrometer diameter fluorescerande kulor (Bangs Laboratories, Fisher, I) i metanol till önskad koncentration. Spädningar av 1:150 från den ursprungliga halter (1% fasta ämnen i pärla buffertlösning) befanns vara lämpliga för våra behov.
  2. Plasma behandla enheten ytan, och sätter in 50-10 ìl pärla suspension.
  3. Vänta på metanol att avdunsta. Upprepa om pärla halten är för låg.
  4. Bild cellen kulturen områden i vila och under belastning.
  5. Öppen källkod automatiserade partikel spårning algoritmer kan sedan användas i ImageJ (NIH) för att spåra pärla förskjutningar.
  6. Deplacement omfattning, riktning och plats parametrar kan sedan användas i en matematisk modell för att karaktärisera stammen fält på enheten ytan.

Ett liknande förfarande kan följas för att karakterisera stammar i 3D-system. Blanda en mängd fluorescerande kulor in i hydrogel föregångare lösning. När det gäller PEG hydrogel systemet, porstorlek är mycket mindre än de 1 pärlor ìm diameter. Pärlor är inkapslade i hydrogel, och systemet kan avbildas med en konfokalmikroskop. Bead förskjutningar kan sedan spåras, analyseras och monteras på en deformation modell.

G. representativa resultat

Representativa resultat för enhet tillverkning, karakterisering och drift finns i figur 5 och 6.

Figur 1
Figur 1. Sandwich mögel tillverkningsprocessen. (A) en overhead öppenhet är noga sänks på ohärdad PDMS på en SU-8 master. (B) smörgås placeras i en skum, glas och metall stack, och härdas i en ugn under kompression. (C) stacken är demonteras och öppenhet skalade bort, behålla mönstrade PDMS lager 3. Reproducerad med tillstånd av Institute of Physics.

Figur 2
Figur 2. Schematisk vertikalt aktiveras micropost vid (A) vila och (B) när den aktiveras. (C) Schematisk bild av flera lager tillverkningsprocessen krävs för att göra en rad microposts 3. Anpassat efter tillstånd av Institute of Physics.

Figur 3
Figur 3. Process ändra microactuator array för att genomföra experiment för celler odlade på ett deformeras tvådimensionell substrat 7. Reproducerad med tillstånd av Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figur 4
Figur 4. Process ändra microactuator array för att genomföra experiment för celler odlade i tredimensionella photopatterned hydrogel konstruktioner 10. Reproducerad med tillstånd av Elsevier.

Figur 5
Figur 5. (A) Exempel på anordning för 2D mechanostimulatory kultur. Rött färgämne som används för att markera aktivering kanalerna trycket leverans och blått färgämne som används för att markera smörjning kanaler. (B) Slumpa bild av en stam karakterisering experiment. Röda prickar representerar undeformed placeringen av pärlor, medan gröna prickar representerar deformerade platserna 7. Reproducerad med tillstånd av Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figur 6
Figur 6. (A) Exempel på anordning för 3D tryckspänning experiment. Grön färg används för att markera aktivering tryck kanaler. (B) Top-down-syn på micropost array med (C) en hydrogel konstruera mönster på toppen av stolpen. (D, E) Side-rekonstruerade bilder av fluorescerande pärlor i hydrogelen bygga under (D) vila och (E) 55 kPa tryck aktivering, som visar processen stamkarakteristik i en 3D-kultur-system 10. Reproducerad med tillstånd av Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även konceptuellt enkel, tar Komponentframställning några experimentella skicklighet och praxis. Särskilt i fallet med 2D-cellodling kan anpassningen av flera lager i enheten vara utmanande, speciellt över en stor yta array. Praktiskt sett kan vi uppnå ett tillförlitligt sätt en 100% ränta anpassning framgång med hjälp av enheter med 50 ìm av tolerans i avståndet mellan närliggande funktioner i flera lager. Vi har också framgångsrikt demonstrerat anpassning till toleranser så låg som 15 ìm, men inriktningen tid som krävs är betydligt större och uppnås vid en lägre framgång. Inriktning av masken photopattern biomaterial på arrayen är lika utmanande, men stolparna kan utformas för att vara ganska stor i jämförelse med hydrogel cylindrarna, lindra denna begränsning.

Andra utmaningar omfattar cellodling på material som beskrivs i detta protokoll. I 2D-stretching-systemet, med hjälp av PDMS som en kultur film gränser biologiska utredning till kortsiktiga experiment, som cell vidhäftning till underlaget börjar komma att påverkas avsevärt efter 6 timmar av stimulering. Detta kan rättas till genom kovalent bindning matrixproteiner till PDMS ytan 11, eller genom att ersätta PDMS substrat cellodling med ett mer kliniskt relevant polyuretanmaterial, för att förbättra celladhesion och ge större flexibilitet i bedrivs biologiska experiment 12. I den beskrivna 3D-systemet är hydrogelen kemi avsedd som ett belysande exempel. Långsiktig kultur från tillhörande celler kräver användning av alternativa naturliga eller syntetiska hydrogeler, eller införandet av adhesiva ligander till PEG matrisen (som lätt kan åstadkommas med hjälp av vanliga PEGylering kemier) 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi erkänner ekonomiskt stöd från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada och den kanadensiska Institutes of Health Research (CHRPJ 323.533 till 06), Ontario Graduate stipendieprogram cm, och Kanada forskning professurer inom mikro-och nano Engineering Systems till YS, och i Mechanobiology till CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  2. Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
  3. Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
  5. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  6. Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
  7. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
  8. Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
  9. Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  10. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
  11. Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
  12. Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
  13. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats