Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Published 12/26/2010
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Bioengineering

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Summary

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

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Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

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Abstract

Die Fähigkeit, systematisch Sonde in vitro zelluläre Reaktion auf Kombinationen von mechanobiological Reize für das Tissue Engineering, Drug Discovery oder grundlegende zellbiologische Studien wird durch aktuelle Bioreaktor-Technologien, die nicht gleichzeitig gelten eine Vielzahl von mechanischen Reizen auf kultivierte Zellen begrenzt. Um dieses Problem zu beheben, haben wir eine Reihe von mikrostrukturierten Plattformen entwickelt, um die Auswirkungen von mechanischen Reizen in einem High-Throughput-Format Bildschirm entwickelt. In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie ist und weiter zu demonstrieren, wie diese Basistechnologie modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und Durchführung werden drei dimensionale Kultur Paradigmen.

Protocol

A. Gerätebeschreibung und Bedienung

Geräte werden unter Verwendung mehrschichtiger Softlithographie 1 in Polydimethylsiloxan (PDMS), und können gleichzeitig erzeugt eine Reihe von mechanischen Bedingungen in einzelnen Zellkultur Standorten in den mikrostrukturierten Array. In diesem Protokoll werden die Schritte, um eine Reihe von pneumatisch betätigten microposts fabrizieren zuerst beschrieben, gefolgt von Schritten, um das Gerät zu modifizieren, um mechanisch dynamischen Kultur in beiden zweidimensionalen (2D) und dreidimensionale (3D-) Kultur Paradigmen zu ermöglichen. Die skizzierten mikrofabrizierten Ansatz erhöht den Durchsatz gegenüber bestehenden makroskopischen Systemen, und ist am besten für das Screening auf die Auswirkungen einer Vielzahl von mechanischen Bedingungen geeignet.

Das Funktionsprinzip des Gerätes ist auf eine Reihe von vertikal betätigt microposts basiert. Microposts auf eine frei aufgehängte Membran hergestellt, und sind gehoben und gesenkt, indem positive und negative Drücke unterhalb der Betätigung Membran (Abbildung 1). Ein wesentliches Merkmal des Arrays ist, dass durch Variation der Größe der Betätigung Membran, einer Druckquelle verwendet werden, um eine Reihe von vertikalen Verschiebungen über das Array zu erhalten. Dieses Prinzip wird verwendet, um schnell Bildschirm zellulären Antwort auf eine Vielzahl von mechanischen stimulierenden Bedingungen in einem einzigen Gerät.

Basierend auf einer analogen makroskopischen design by Schaffer et al. 2, umfasst unser Design eine zweite suspendiert und geschmiert Zellkultur Film über die Post, ermöglicht den Zellen, 2D Substratdeformation wie die Kultur Film gleitet über die erhöhte Belastung post Erfahrung. Alternativ ermöglicht Photostrukturierungsverfahren eine Reihe von Zell-beladenen Hydrogele über die Be-Beiträge für Druck-Stimulation von Zellen in 3D-Kultur. Detaillierte Anweisungen bei der Einrichtung dieser Systeme folgen.

B. Herstellung der pneumatischen Mikroaktor Array

Herstellung des pneumatischen Mikroaktor Array erfordert strenge Ausrichtung in Multilayer-PDMS-Strukturen. Das ist eine Herausforderung, durch Schrumpfung-induzierte Ausrichtung Registrierung Fehler. Um dies zu beheben, verwenden wir einen Fertigungsprozess genannten "Sandwich-Formenbau" 3, gezeigt, effektiv zu beseitigen diesem Heft 4.

Aufbereitungstechnik

  1. Single-oder Multi-Level-SU-8 Meister für jede der verschiedenen Ebenen werden in einem Reinraum unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Für diese Geräte sind Meister 200-400 um dick, je nach Anwendung. Masters sind bei 80 ° C für 3 Tage vor der Verwendung hardbaked.
  2. Saubere Glas-Folien und die SU-8-Master sind in einer Vakuumkammer silanisiert, um die Haftung der Aushärtung PDMS, um die Materialien zu verhindern. In einem Abzug durchzuführen, ist 60 ul der Silanisierungsmittel (Tridecafluor-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-Trichlorsilan (United Chemical Technologies, Bristol, PA) in eine Petrischale in die Kammer pipettiert. Die nackten Glas-und SU-8-Master sind in der Kammer aufgestellt und unter Vakuum über Nacht.
  3. Zwei Schaumstoff-Pads (erhältlich im Handwerk Versorgung-Läden) und einem Overhead-Inkjet-Transparentfolie sind die Größen etwas größer als die SU-8-Master für Sandwich-Formenbau eingesetzt geschnitten.

Sandwich Formenbau

  1. Jede Schicht des mehrschichtigen Gerät benötigt eine PDMS-Schicht geformt mit dieser Methode. Eine schematische Darstellung des Sandwich-Formenbau-Prozess ist in Abbildung 1 dargestellt.
  2. PDMS Monomer und Vernetzer sind durchaus in der Norm im Verhältnis 10:1 gemischt. 3 ml unausgehärtet PDMS-Mischung werden auf einer zuvor gefertigten SU-8 Master hinterlegt und entgast in einer Vakuumkammer.
  3. Die Schaumstoffpolster und SU-8-Master sind auf einem Plexiglas-Grundplatte gelegt.
  4. Die Transparenz wird vorsichtig auf das ungehärtete PDMS abgesenkt, so dass Sie sicher zu vermeiden, Trapping Luftblasen. Inkjet-Folien haben eine raue und eine glatte Seite, und es ist wichtig, dass die glatte Seite Kontakte den ungehärteten PDMS.
  5. Eine silanisierte Glasträger befindet sich oben auf die Transparenz gelegt, unter dem zweiten Schaumstoffpolster und eine Plexiglas-Deckplatte. Das Sandwich wird dann zusammen mit einem C-geklemmt.
  6. Die PDMS-Sandwich wird in einem Ofen bei 80 ° C für mindestens 4 Stunden ausgehärtet.
  7. Das Sandwich wird aus dem Ofen genommen und darf vor dem Entfernen der Klemme cool.
  8. Die Klemme wird entfernt und das Sandwich auseinandergebaut und die Schaumstoff-Pads werden verworfen. Die Transparenz wird sorgfältig entfernt von der SU-8 Master geschält, Beibehaltung der gemusterten PDMS-Film.
  9. Diese gemusterten PDMS-Schichten und deren Handhabung Transparenz Schichten können dann in einer staubfreien Umgebung gelagert werden, bis sie einsatzbereit sind. Wir haben erfolgreich PDMS-Schichten verwendet bis zu zwei Monate alt, ohne erkennbare schädliche Wirkung.

Der Bau der Multilayer-Gerät

t "> Der Schaltplan für die Herstellung der Mikroaktor Array ist in Abbildung 2A, und den Betrieb der Aktoren ist in den Abbildungen 2B und C gezeigt, dass das Gerät herzustellen:

  1. Die unterste gemusterten PDMS-Schicht wird durch Sandwich-Formenbau vorbereitet. Für diese Experimente wurden kreisförmige Muster von 600 bis 1200μm Durchmesser verwendet.
  2. Die PDMS-Schicht wird dann auf einen sauberen Glasobjektträger übertragen. Eine Korona-Entladung Einheit wird verwendet, um die PDMS-und Glasoberflächen mit Sauerstoff-Plasma zu behandeln, und die beiden Oberflächen in Kontakt mit einander platziert. Der Stapel wird dann auf einer Heizplatte bei 80 ° C gelegt, um die Bindung abzuschließen. Die Transparenz kann dann abgeschält und entsorgt. Während dieses Prozesses wird die strukturierte PDMS Film nie von einem starren Substrat freigesetzt und verhindert Schrumpfung der einzelnen Schichten.
  3. Je nach Erfolg des Mehrkomponentenspritzguss Schritt, dünnen Filmen aus PDMS, die nicht durchgeführt wurden, aus zwischen dem SU-8-Funktionen und die Transparenz drückte müssen eventuell entfernt werden. Dies kann manuell über eine 25G-Nadel unter einem Stereoskop werden.
  4. Die zweite Sandwich-Schicht geformt ist als eine negative Replik Form des gewünschten Membran-und-post-Struktur gebildet. Dies liegt daran, Herstellung von großflächigen SU-8 Meister ist eine Herausforderung, aber die Verwendung von alternativen Herstellungsprozessen konnte diesen zusätzlichen Schritt zu beseitigen. In dieser Demonstration wurden kreisförmige Beiträge 500 pm im Durchmesser verwendet. Der negative Replik Form wird silanisiert und vorübergehend auf einem Glasträger mit doppelseitigem Klebeband befestigt. Unausgehärtete PDMS abgeschieden wird, entgast und auf diese Sandwich-Form Schicht für 45 Sekunden bei 1000 RPM Spin-Coating, wodurch eine Betätigung Membran 60 pm dick. Die Spin-Coating PDMS-Schicht bei 80 teilweise geheilt ° C für ca. 20 Minuten, oder bis die PDMS klebrig ist, aber nicht dauerhaft verformen, wenn sie berührt.
  5. Die Objektträger aus Glas und doppelseitigem Klebeband aus dem teilweise geheilt PDMS-Schicht, die dann mit Plasma behandelte, umgedreht und in eine maßgeschneiderte Aligner entfernt. Die Aligner besteht aus einem Vakuum-Chuck angebracht, um einen Mikromanipulator (Siskiyou; Mission Viego, CA, USA). Die erste PDMS-Schicht wird dann mit Plasma behandelten und auf einer Drehbühne (Newmark, Grants Pass, OR, USA), unter dem Vakuum-Chuck und Ausrichtung zwischen den beiden Schichten beobachtet wird mit einem 12fach-Zoom Navitar Machine-Vision-System (Navitar; Rochester, NY, USA).
  6. Die Schichten sind ausgerichtet mit dem Manipulator und sorgfältig in Kontakt gebracht. Das Sandwich wird dann von der Aligner entfernt und in einem Ofen gehärtet bei 80 ° C für weitere 30 Minuten. Die Transparenz und silanisiert Replik PDMS Form kann dann aus der Vorrichtung abgezogen und entsorgt. Das Gerät ist dann vollständig bei 80 ° C für mindestens vier Stunden ausgehärtet.
  7. Abhängig von der Art der mechanischen Stimulation Experiment wird durchgeführt, können zusätzliche PDMS-Schichten dann auf dieser Basis Gerät durch Wiederholung der beschriebenen Verfahren verbunden werden. Details zu den verschiedenen Arten der mechanischen Stimulation Experimente sind in den Abschnitten C und D. zur Verfügung gestellt

Connectors

  1. Sobald das Gerät abgeschlossen ist, kann eine Nadel benutzt, um die PDMS-Schicht an der Stelle der Verbindung klar sein.
  2. Handelsregister-Anschlüsse, wie die Nanoport (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA) kann dann als Schnittstelle zu externen Schläuche verwendet werden. Um zu vermeiden, die Höhe Anforderungen an kommerzielle Anschlüsse und damit verwenden Standard-Petrischalen als Gerät Container, fertigen wir unsere eigenen wie folgt.
  3. Etwa 35 g des PDMS gegossen und in einer omni-well Schale ausgehärtet (Nunc, Rochester, NY, USA). Das Gerät ist geschält und in kleine Dichtung Abschnitte, aus denen ein 1 / 8 "Loch entfernt ist mit einem Stempel.
  4. Ein 18G abgestumpft Nadel wird benutzt, um Kern aus einem Ausschnitt aus der Seite der Dichtung. Eine kleinere 21G Nadel wird benutzt, um den zentralen Kern vor Aberkennung der 18G Nadel entfernen.
  5. Etwa 15 g PDMS gegossen und in einer omni-well-Fach Deckel geheilt, geschält und in ähnlich großen Abschnitt. In diesem Abschnitt wird dann mit Klebeband gereinigt, an die Spitze der Dichtung Plasma-gebundenen, und das Gerät ist an das Gerät Plasma-gebundenen, gestanzt Seite nach unten.
  6. Eine zweite stumpf 18G Nadel wird dann von den farbigen Kunststoff-Luer-Anschluss getrennt, eingefügt in die entkernten Loch und versiegelt in Stelle mit ein paar Tropfen PDMS. Die daraus resultierende Stecker ist sehr effektiv, sparsam und hat ein Totraumvolumen groß genug, um Luftbläschen in die Kanäle während Flüssigkeitsfüllung Stadien zu verhindern.

C. Mechanisch aktive 2D-Kultur Substrate

Das Array von betätigt microposts können verschiedene Belastungen Profile in einer abgehängten Polymerfolie, auf denen Zellen kultiviert werden zu erstellen. Raising the post in eine geölte Film bewirkt, dass der Film zu rutschen und um den Pfosten zu verformen. Mit einer kreisförmigen Be-post-Ergebnisse in einer equibiaxial Dehnungsverteilung, aber dieDesign ist, dass unterschiedliche Formen post vielseitig kann eine Vielzahl von Belastungen Felder zu erzeugen. Zum Ändern der Aktor-Arrays für 2D-Kultur-Experimente (schematische Abbildung 3):

  1. Bond ein Drittel PDMS-Schicht auf das Gerät, wie in Abbildung 3a dargestellt. Die dritte Schicht PDMS besteht aus einem zweischichtigen Aufbau. Der untere Kreis entspricht der Größe der Betätigung Hohlraum unter dem betätigten microposts. Der Durchmesser des oberen Kreises ist 100 um größer als der Durchmesser der Beladung Beiträge. A 200 um breit Mikrokanal verbindet diese Eigenschaften zu einem Anschlussbereich, und wird verwendet, um die Be-Beiträge und Kultur Film zu schmieren.
  2. Fabrizieren und Bindung Anschlüsse an das Gerät, wie zuvor beschrieben.
  3. Spin Mantel eine 10-15 um dicke Schicht aus PDMS auf die glatte Seite eines Transparenz (Spin-Parameter: 4000 RPM, 120 Sekunden). Cure bei 80 ° C für mindestens 4 Stunden.
  4. Appy eine Low-Level Vakuum (Barnant Air Cadet Absaugpumpe) zu den Aktoren, eine Senkung der Vielzahl von Beiträgen.
  5. Plasma zu behandeln und Bindung der Spin beschichteten PDMS-Film auf die Betätigung Kleinstgerätes. Legen Sie auf einer Heizplatte bei 80 ° C für 10 Minuten. Die Beiträge und Kultur Film bleibt für eine kurze Zeit hydrophil.
  6. Füllen Sie die Schmierung Kanäle mit einer 90% Glycerin in VE-Wasser-Lösung. Neben der Schmierung, hält diese Formulierung die Hydrophilie des PDMS auf unbestimmte Zeit, Reduzierung der Reibung Koeffizienten. Luftblasen gefangen bleiben zwischen der Post und der Kultur Film. Stellen Sie das Gerät auf einer Heizplatte bei 40 ° C, und weiterhin Schmiermittel in den Kanal injiziert, wodurch ein kleiner Druck zu erhöhen. Nach ein paar Minuten wird die Luftblasen durch die PDMS diffuse, und alle Oberflächen werden geschmiert werden.
  7. Entfernen Sie den negativen Druck, die Freigabe der Beiträge.
  8. Mit einem Skalpell geschnitten um die dünne PDMS-Film. Lösen Sie vorsichtig die Transparenz Rückendeckung vom Gerät weg.
  9. Plasma-Bindung ein von Hand zugeschnittenes PDMS Dichtung um das Gerät Kulturkreis.
  10. Sterilisieren Sie das Gerät durch Einweichen in 70% Ethanol für 5 Minuten, und dann unter einem keimtötenden UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank für 45 Minuten.
  11. Plasma behandeln die Oberfläche und inkubieren mit 100 pg / mL Kollagen (oder alternative ECM-Protein) über Nacht bei 4 ° C.
  12. Waschen Sie die Vorrichtung mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), und Samenzellen bei 10-15000 Zellen / cm 2, nach Standard-Zellkultur-Protokolle.

Detaillierte Charakterisierung von Kleinstgerätes Betrieb und biologische Experimente auf dieser Plattform durchgeführt wurden an anderer Stelle 7 veröffentlicht.

D. Mechanisch aktive 3D-Hydrogele

Änderungen am Gerät kann auch verwendet werden, um Kompression photostrukturierten zu ermöglichen. Zell-laden, dreidimensionale Hydrogele in einem High-Throughput Weise. In diesem Beispiel erstellen wir 350 Mikrometer Durchmesser Polyethylenglykol (PEG)-Hydrogel-Zylinder, Verkapselung C3H10T1 / 2 Maus mesenchymalen Stammzellen, und wenden Sie Druckspannungen reichen von 5 bis 25% über dem Array. Dieses Protokoll kann mit erweiterten Hydrogel Photopolymerisation Chemikalien verwendet werden. Um die Plattform für Experimente im dreidimensionalen Mechanobiologie (schematisch in Abb. 4) zu verwenden:

Geräte-Änderungen:

  1. Bestreichen Sie die Beiträge mit einer 1 um dicke Schicht aus Parylen-C, um die Gasdurchlässigkeit zu reduzieren und die Polymerisation Mal in der PEG-Hydrogel-System. Dadurch wird die zytotoxische Wirkung der freien Radikalen basierenden Photopolymerisationsreaktion. Pieces of Klebeband verwendet werden, um die Gebiete rund um die Post-Maske und das Gerät ist in einem PDS 2010 LabCoter 2-System beschichtet (Specialty Coating Systems; Indianapolis, IN, USA).
  2. Die beschichteten Gerät wird aus der Beschichtungsanlage entfernt, und das Klebeband abgeschält, so dass eine konforme Schicht Parylene-C über die Beiträge.
  3. Ein Deckglas ist 8 durch Untertauchen methacrylierte in eine 2% v / v Lösung von 3 - (trimethoxysilyl) propylmethacrylat in 95% Ethanol für 2 Minuten.
  4. Das Deckglas wird in 100% Ethanol gespült und gebacken bei 100 ° C, so dass Methacrylatgruppen auf der Oberfläche.
  5. A 200 um dicken PDMS spacer Film ist in einer Petrischale gegossen, und schneiden Sie in kleine Abschnitte. Vier dieser kleinen Abschnitte sind Plasma um den Rand des methacrylierte Deckglas geklebt.
  6. Die Abstandshalter werden dann Plasma in die PDMS-Bereiche des Geräts, für die Parylene-C beschichtet Beiträge gebunden.
  7. Das Gerät ist durch Waschen in 70% Ethanol, und die Belastung durch keimtötende UV-Licht in einem biologischen Sicherheitsschrank für 45 Minuten sterilisiert.

In-situ-Polymerisation:

Cell-beladene PEG-Hydrogele wurden dann photolithographisch in die Geräte 8,9 wie folgt strukturiert:

  1. Bereiten Sie eine 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio, Arab, AL, USA) und 10% w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)Lösung in unsupplmented Zellkulturmedien.
  2. Bereiten Sie einen Photoinitiator Stammlösung von 100 mg / ml Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, USA) in 1-Vinyl-2-Pyrolidinon.
  3. Gründlich mischen die beiden vorbereiteten Lösungen zusammen, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,4% w / v von Photoinitiator zu erhalten. Filtern Sie die Mischung durch ein 0,45 um Spritzenfilter zu sterilisieren und zu entfernen Partikel.
  4. Trypsinize Zellkulturen und bereiten eine Zellsuspension in Kulturmedien, auf das Doppelte der gewünschten Endpunkt Zellkonzentration.
  5. Mischen Sie die Zellsuspension und die gefilterte Hydrogel-Vorläufer / Photoinitiator Lösung in einem Verhältnis von 1:1.
  6. Injizieren Sie die Lösung in die Kleinstgerätes mit einem langen 25G-Nadel. Sorgfältig zu vermeiden Trapping Blasen in das Gerät.
  7. Richten Sie ein gedrucktes Transparenz Maske Ausrichtungsmarkierungen auf der Oberfläche der Vorrichtung. Einrichten einer UV-Beleuchtungssystem mit einer UV-Dosis von 17,5 mW / cm 2 auf der Oberfläche der Vorrichtung bereitzustellen. Illuminate das Hydrogel durch die Maske für 195 s. Diese Zeit ist für unser System wurde optimiert, und müssen unter Umständen angepasst werden.
  8. Wegspülen unpolymerisierte Hydrogel-Vorläufer-Lösung mit PBS, und ersetzen Sie die PBS mit Kulturmedien. Betätigen Sie den Laden Beiträge zum Hydrogel-Konstrukte zu komprimieren.

Detaillierte Charakterisierung von Kleinstgerätes Betrieb und biologische Experimente auf dieser Plattform durchgeführt wurden an anderer Stelle veröffentlicht 10.

E. Peripheriegeräte

Geändert Petrischalen verwendet werden, um die Sterilität der Zellkulturen während der Betätigung der Geräte zu erhalten. Eine stumpfe und gestrippt 18G Nadel wird in ein Loch in der Seite der Petrischale gebohrt geklebt. Tubing (Clay Adams Intramedic PE190, VWR International, Arlington Heights, IL, USA) ist mit diesen Anschlüssen verpresst und verbindet sich mit der kontrollierten Magnetventile und Druckquelle.

Drücke bis zu den Geräten werden durch externe Mikropumpen zur Verfügung gestellt. Für den 2D-Experimenten wurden positive Druckwerte von 30 bis 55 kPa unter Verwendung eines spannungsgesteuerten Exzenter-Membranpumpe (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Deutschland). Ein Puls-Weiten-Modulation basiert Spannungsregler wird verwendet, um die angelegte Spannung variieren, um den Druck Ausgabe zu steuern. Magnetventile und Verteiler (S10MM-30-12 bis 3 und MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) werden verwendet, um eine zyklische Druckkurve zu schaffen. Die Ventile sind mit einem 12 V-Signal durch einen quadratischen Wellenform Funktionsgenerator gesteuert betätigt.

F. Gerät Charakterisierung und Anwendung

Imaging auf dem Gerät

Ein häufiges Problem mit bildgebenden Zellen oder Partikel auf dem Gerät ist schlecht optische Auflösung aufgrund der Kondensation von Tropfen unter der PDMS-Film zur Unterstützung der Be-post. Diese Kondensation entsteht aus Temperatur und Luftfeuchtigkeit im Innenraum des Inkubators und nach der Fixierung oder auf einem Mikroskop-Bühne. Um dieses Problem zu lösen:

  1. Schließen Sie ein offenes Reservoir, um den Druck Einlass, und füllen Sie mit destilliertem Wasser. Wir verwenden eine offene Spritze mit Luer-Lock-Anschluss für die Bequemlichkeit.
  2. Stellen Sie das Gerät und füllte Reservoir in einer Vakuumkammer und Abpumpen.
  3. 5 Minuten warten, und bringt die Kammer auf Atmosphärendruck. Wiederholen Sie die zwei-oder dreimal. Da Luft aus den Kanälen des Gerätes verdrängt, wird es mit Wasser aus dem Reservoir ersetzt, wodurch die Tröpfchen kondensiert und eine klare optische Weg für die Mikroskopie.
  4. Bild Kulturkreisen mit Hellfeld-oder Fluoreszenz-Mikroskopie.

Für Live Cell Imaging, kann dieses Verfahren vor der Aussaat der Zellen auf den Geräten ausgeführt werden. Allerdings muss Kanälen ausgelegt groß genug für jede viskosen Druckverlusten zwischen den Einheiten auf dem Gerät zu verhindern.

Stammcharakterisierung von Wulst Tracking

Auf der 2D-Kultur-Systeme:

  1. Verdünnen Sie 1 Mikrometer Durchmesser fluoreszierende Kügelchen (Bangs Laboratories; Fisher, IN) in Methanol auf die gewünschte Konzentration. Verdünnungen von 1:150 aus der ursprünglichen Konzentrationen (1% ig in bead Pufferlösung) erwiesen sich als geeignet für unsere Bedürfnisse.
  2. Plasma behandeln die Oberfläche der Vorrichtung, und Kaution 5-10 ul der Bead-Suspension.
  3. Warten Sie, bis das Methanol verdampft. Wiederholen Sie, wenn Wulst-Konzentration ist zu niedrig.
  4. Bild der Zellkultur Bereiche in Ruhe und unter Belastung.
  5. Open-Source-automatisierte particle tracking Algorithmen können dann in ImageJ (NIH) genutzt werden, um bead Verschiebungen zu verfolgen.
  6. Displacement Größe, Richtung und Position-Parameter können dann in ein mathematisches Modell verwendet werden, um Belastungen Felder auf der Oberfläche der Vorrichtung zu charakterisieren.

Ein ähnliches Verfahren kann zu Belastungen in 3D-Systemen zu charakterisieren. Mix eine Menge fluoreszierende Kügelchen in die hydrogel Precursorlösung. Im Falle der PEG-Hydrogel-System sind die Porengrößen viel kleiner als die des 1 Mikrometer Durchmesser Perlen. Beads sind in dem Hydrogel gekapselt, und das System kann aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop werden. Bead Verschiebungen können dann verfolgt, analysiert und ausgestattet, um eine Verformung Modell.

G. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für Geräte Herstellung, Charakterisierung und Bedienung sind in den Abbildungen 5 und 6 vorgesehen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Sandwich Form Fertigungsprozess. (A) Ein Overhead wird vorsichtig auf unausgehärtet PDMS auf einer SU-8 Master gesenkt. (B) Das Sandwich wird in einen Schaumstoff, Glas und Metall-Stack gelegt, und in einem Ofen gehärtet unter Druck. (C) Der Stapel wird demontiert und die Transparenz abgeschält, Beibehaltung der gemusterten PDMS-Schicht 3. Reproduziert mit Bewilligung des Institute of Physics.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung des vertikal betätigt micropost bei (A) Ruhe und (B) bei Betätigung. (C) Schematische Darstellung der Multilayer-Herstellungsprozess benötigt, um eine Reihe von microposts 3 machen. Adaptiert mit Erlaubnis des Institute of Physics.

Abbildung 3
Abbildung 3. Prozess um Mikroaktor Array ändern, um Experimente für Zellen auf einem Verformen zweidimensionalen Substrat 7 kultivierten Verhaltens. Nachdruck mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Abbildung 4
Abbildung 4. Prozess um Mikroaktor Array ändern, um Experimente für Zellen im dreidimensionalen photostrukturierten Hydrogel kultiviert Verhalten Konstrukte 10. Nachdruck mit Genehmigung von Elsevier.

Abbildung 5
Abbildung 5. (A) Sample-Gerät für 2D mechanostimulatory Kultur. Roter Farbstoff verwendet, um den Steuerdruck Vertriebskanäle und blauen Farbstoff verwendet werden, um die Schmierung Kanäle markiert markieren. (B) Beispiel-Bild einer Charakterisierung des Stamms zu experimentieren. Rote Flecken stellen die unverformten Lage der Perlen, während grünen Flecken der deformierten Stellen entfallen 7. Nachdruck mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Abbildung 6
Abbildung 6. (A) Beispiel für 3D-Druck-Experimenten. Grünen Farbstoff verwendet, um Betätigungsdruck Kanäle markiert werden. (B) Top-Down-Sicht der micropost Array mit (C) ein Hydrogel auf der Oberseite des post gemusterten konstruieren. (D, E) Side-rekonstruierten Bilder von fluoreszierenden Kügelchen in das Hydrogel unter (D) Ruhe und (E) 55 kPa Betätigungsdrücke konstruieren, was die Charakterisierung des Stamms Prozess in einer 3D-Kultur-System 10. Nachdruck mit Genehmigung von Elsevier.

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Discussion

Obwohl konzeptionell einfach, Bauelementherstellung dauert einige experimentelle Geschick und Übung. Insbesondere im Falle von 2D-Zellkultur kann die Ausrichtung der mehrere Schichten in das Gerät eine Herausforderung sein, vor allem über eine großflächige Arrays. Praktisch gesehen, können wir sicher erreichen eine 100% ige Ausrichtung Erfolgsrate mit Hilfe von Geräten mit 50 um der Toleranz in Abstand zwischen benachbarten Funktionen in mehreren Schichten. Wir haben auch erfolgreich Ausrichtung mit Toleranzen bis zu 15 mu m gezeigt, aber die Angleichung Zeitaufwand ist wesentlich größer und wird mit einer niedrigeren Erfolgsquote erreicht. Die Ausrichtung der Maske photopattern Biomaterialien auf das Array ist ebenfalls eine Herausforderung, aber die Beiträge können so konzipiert, dass sehr groß im Vergleich zu den Hydrogel-Zylinder sein, der Linderung dieser Einschränkung.

Weitere Herausforderungen betreffen Zellkultur auf die Materialien in diesem Protokoll beschrieben. In der 2D-Stretching-System, mit PDMS als Kultur Film Grenzwerte biologische Untersuchungen auf kurzfristige Versuche, als Zell-Adhäsion auf dem Substrat beginnt deutlich nach 6 Stunden Stimulation beeinflusst werden. Dies kann durch kovalent bindende Matrix-Proteine ​​an die PDMS-Oberfläche 11, oder durch den Austausch des PDMS Zellsubstrates mit einer klinisch relevanten Polyurethan-Material, um die Zelladhäsion zu verbessern und eine größere Flexibilität bei durchgeführten biologischen Experimenten 12 gleichgerichtet werden. In der beschriebenen 3D-System ist das Hydrogel Chemie als ein anschauliches Beispiel bestimmt. Langfristige Kultur von adhärenten Zellen erfordert die Verwendung von alternativen natürlichen oder synthetischen Hydrogele, oder die Aufnahme von Klebstoff Liganden in der PEG-Matrix (die leicht erreicht werden kann mit Standard-PEGylierung Chemie) 13.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und der Canadian Institutes of Health Research (CHRPJ 323533-06), der Ontario Graduate Scholarship-Programm CM, und die Canada Research Chairs in Mikro-und Nano Engineering Systems zu YS, und in Mechanobiologie zu CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
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Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

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