Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

Published 12/26/2010
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Cite this Article

Copy Citation

Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A habilidade de sondar sistematicamente in vitro resposta celular a combinações de estímulos mechanobiological para engenharia de tecidos, descoberta de drogas ou estudos biológicos fundamentais célula é limitado pelo biorreator tecnologias atuais, que não pode, simultaneamente, aplicar uma variedade de estímulos mecânicos nas células em cultura. , A fim de resolver este problema, temos desenvolvido uma série de plataformas microfabricated projetado para tela para os efeitos dos estímulos mecânicos em um formato de alto rendimento. Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e ainda demonstrar como esta tecnologia de base pode ser modificada para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos os bidimensionais e três dimensional paradigmas cultura.

Protocol

A. descrição de dispositivos e operação

Dispositivos são fabricados utilizando litografia macia multicamadas 1 em PDMS (polidimetilsiloxano), e são capazes de, simultaneamente, gerando uma série de condições mecânicas em locais de células individuais cultura entre a matriz microfabricated. Neste protocolo, os passos para fabricar um conjunto de pneumático são acionadas microposts descrita pela primeira vez, seguido por etapas para modificar o dispositivo para permitir a cultura mecanicamente dinâmica em ambos os bidimensionais (2D) e tridimensionais paradigmas (3D) cultura. A abordagem descrita microfabricated aumenta o rendimento sobre os actuais sistemas de macroescala, e é o mais adequado para a triagem para os efeitos de uma variedade de condições mecânicas.

O princípio operacional do dispositivo é baseado em uma matriz de microposts vertical acionado. Microposts são fabricados em um diafragma livremente suspenso, e são levantados e abaixados, aplicando pressões positivas e negativas abaixo do diafragma atuação (Figura 1). Uma característica chave da matriz é que ao variar o tamanho do diafragma de atuação, uma fonte de pressão único pode ser usado para obter uma série de deslocamentos verticais em todo o array. Este princípio é utilizado para a rápida resposta da tela de celular para um grande número de condições estimulantes mecânica através de um único dispositivo.

Com base em um design semelhante macroescala por Schaffer et al. 2, nosso projeto inclui um filme de segunda cultura em suspensão e lubrificado célula ao longo do post, permitindo que as células de experimentar deformação substrato 2D como os deslizamentos cultura cinematográfica sobre a pós carga levantada. Alternativamente, array photopatterning uma de célula-laden hidrogéis sobre os posts de carregamento permite a estimulação de compressão de células em cultura 3D. Instruções detalhadas na criação destes sistemas a seguir.

B. Fabricação de matriz microactuator pneumáticos

Fabricar a matriz microactuator pneumáticos exige alinhamento rigoroso em estruturas multicamadas PDMS. Este é um desafio, devido ao encolhimento induzida por erros de registro de alinhamento. Para resolver isso, usamos um processo de fabricação chamado de "fabricação de moldes sanduíche" 3, mostrado eficaz para eliminar este problema 4.

Preparação de materiais

  1. Simples ou multi-nível SU-8 mestres para cada um dos vários níveis são fabricados em uma sala limpa utilizando os procedimentos padrão. Para esses dispositivos, os mestres são 200-400 mm de espessura, dependendo da aplicação. Mestres são hardbaked a 80 ° C por três dias antes do uso.
  2. Lâminas de vidro limpo e os mestres SU-8 são silanizadas em uma câmara de vácuo, para impedir a adesão de cura PDMS aos materiais. Em um fumehood, 60 mL do agente silanização (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (United Chemical Technologies, Bristol, PA) é pipetado em uma placa de Petri na câmara. O vidro nua e SU-8 mestres são colocados na câmara e mantidos sob vácuo durante a noite.
  3. Duas almofadas de espuma (disponível em lojas de artesanato) e um filme de transparências jato de tinta são cortadas em tamanhos ligeiramente maior do que o mestre SU-8 usado para a fabricação de moldes sanduíche.

Fabricação Mold Sandwich

  1. Cada camada do dispositivo de múltiplas camadas requer uma camada de PDMS moldado utilizando este método. Um esquema do processo de fabricação de moldes sanduíche é fornecido na Figura 1.
  2. PDMS monômero reticulador e são completamente misturado na proporção de 10:1 padrão. 3 mL da mistura de PDMS não curado são depositados em um anteriormente fabricados mestre SU-8, e desgaseificados em uma câmara de vácuo.
  3. A almofada de espuma e SU-8 mestres são colocados em uma placa de base plexiglass.
  4. A transparência é cuidadosamente abaixada na PDMS não curado, certificando-se para evitar armadilhas as bolhas de ar. Transparências jato de tinta tem uma vaga e um lado suave, e é importante que os contatos lado liso do PDMS não curado.
  5. A lâmina de vidro silanizadas é colocado em cima da transparência, sob a almofada de espuma e um segundo tampo de acrílico. O sanduíche é, então, preso junto com um C-clamp.
  6. O sanduíche PDMS é curada em estufa a 80 ° C durante pelo menos 4 horas.
  7. O sanduíche é retirado do forno e deixar arrefecer antes de retirar a braçadeira.
  8. O grampo é removido e desmontado o sanduíche, e as almofadas de espuma são descartados. A transparência é cuidadosamente descoladas do mestre SU-8, mantendo o padrão de filmes PDMS.
  9. Estas camadas padronizadas PDMS e suas camadas de transparência manuseio podem ser armazenados em um ambiente livre de poeira até que estejam prontos para uso. Temos utilizado com sucesso camadas PDMS até dois meses de idade, sem efeitos deletérios perceptível.

Construção do dispositivo de multicamadas

t "> O esquema para a fabricação da matriz microactuator é fornecido na Figura 2A e operação dos atuadores é mostrado nas Figuras 2B e C. Para fabricar o dispositivo:

  1. A mais baixa camada de PDMS padrão é preparada por fabricação de moldes sanduíche. Para estes experimentos, os padrões circulares que vão de 600 a 1200μm de diâmetro foram usados.
  2. A camada de PDMS é então transferido para uma lâmina de vidro limpa. A unidade de descarga corona é utilizado para tratar as superfícies de PDMS e vidro, com plasma de oxigênio, e as duas superfícies são colocados em contato uns com os outros. A pilha é então colocado numa placa de aquecimento a 80 ° C para completar o processo de colagem. A transparência pode ser desfeito, e descartados. Durante este processo, o padrão de filmes PDMS nunca é liberada a partir de um substrato rígido, impedindo o encolhimento das camadas individuais.
  3. Dependendo do sucesso da etapa de moldagem sanduíche, filmes finos de PDMS que não tenham sido expulsos de entre o SU-8 características e da transparência pode precisar de ser removido. Isto pode ser feito manualmente, usando uma agulha de 25G sob um estereoscópio.
  4. A camada de sanduíche segundo moldado é formada como um molde negativo réplica da estrutura desejada diafragma e pós-. Isto é porque a fabricação de grande-área SU-8 mestres é um desafio, mas o uso de processos de fabricação alternativo poderia eliminar essa etapa extra. Nesta demonstração, circular posts 500 mm de diâmetro foram usados. O molde negativo é silanizadas réplica, e, temporariamente, aposta numa lâmina de vidro com fita dupla face. Não curado PDMS é depositado, desgaseificados e spin-revestido para esta camada de mofo sanduíche de 45 segundos a 1000 RPM, produzindo um diafragma de atuação 60 mm de espessura. O spin-revestido camada de PDMS é parcialmente curado a 80 ° C para ~ 20 minutos, ou até que o PDMS é pegajoso, mas não deformar permanentemente quando tocado.
  5. A lâmina de vidro e fita dupla face são removidos do parcialmente curado PDMS camada, que é, então, tratados com plasma, invertido e colocado em um alinhador feito por encomenda. O alinhador consiste em um mandril a vácuo montado em um micromanipulador (Siskiyou; Missão Viego, CA, EUA). A camada de PDMS primeira é, então, plasma-tratado e colocado em um palco rotativo (Newmark, Grants Pass, OR, EUA), sob o chuck vácuo, e alinhamento entre as duas camadas é observado usando um zoom 12x Navitar sistema de visão de máquina (Navitar; Rochester, NY, EUA).
  6. As camadas estão alinhadas com o manipulador, e cuidadosamente colocados em contato. O sanduíche é então removido do alinhador, e curada em estufa a 80 ° C por mais 30 minutos. A transparência ea silanizadas réplica molde PDMS podem ser descascadas a partir do dispositivo e descartados. O dispositivo é então completamente curada a 80 ° C durante pelo menos quatro horas.
  7. Dependendo do tipo de experimento estimulação mecânica sendo conduzida, camadas adicionais PDMS podem então ser ligado a este dispositivo de base, repetindo o processo descrito. Detalhes para os vários tipos de experimentos estimulação mecânica são fornecidos nas seções C e D.

Conectores

  1. Uma vez que o dispositivo é completado, uma agulha pode ser usado para limpar a camada de PDMS no ponto de conexão.
  2. Conectores comerciais, tais como o Nanoport (Upchurch Científico; Oak Harbor, WA, EUA) pode então ser usada para fazer interface com tubulação externa. Para evitar os requisitos de altura de conectores comerciais, e, assim, usar pratos petri padrão como recipientes dispositivo, podemos fabricar nossos próprios como se segue.
  3. Aproximadamente 35 g de PDMS é lançado e curado em uma bandeja de omni-bem (Nunc, Rochester, NY, EUA). O dispositivo é descascada e cortada em seções junta de pequeno porte, a partir do qual um 1 / 8 "buraco é removido com um soco.
  4. Uma agulha de 18G blunted é usado para o núcleo para fora uma seção do lado da junta. Uma pequena agulha 21G é usado para remover o núcleo central antes de retirar a agulha 18G.
  5. Aproximadamente 15g de PDMS é lançado e curado em uma tampa da bandeja omni-bem, descascadas e cortadas em seção de tamanho similar. Esta seção é então limpa com fita adesiva, plasma-ligado ao topo da junta, ea unidade é plasma-ligado ao dispositivo, o lado perfurado para baixo.
  6. Uma agulha 18G blunt segundo é então separado do conector plástico colorido luer, inserido no orifício tubular e selados no local com algumas gotas de PDMS. O conector resultante é bastante eficaz, econômica e tem um volume morto de espaço grande o suficiente para evitar bolhas de ar entre os canais durante as fases de enchimento líquido.

C. mecanicamente ativo 2D substratos cultura

A matriz de microposts acionado podem ser usados ​​para criar perfis de tensão diferentes em um filme de polímero em suspensão, na qual as células são cultivadas. Elevar a pós em uma película lubrificada faz com que o filme a escorregar e deformar todo o post. Usando um resultado pós-circular de carga em uma distribuição de tensão equibiaxial, mas odesign é versátil em que as formas pós diferentes podem ser usados ​​para criar uma variedade de campos de tensão. Para modificar a matriz de atuadores para experimentos de cultura 2D (esquemática na Figura 3):

  1. Ligação de uma camada PDMS terceiro para o dispositivo, como mostrado na Figura 3a. A camada de PDMS terceiro consiste em uma estrutura de duas camadas. O círculo inferior corresponde ao tamanho da cavidade atuação abaixo da microposts acionado. O diâmetro do círculo superior é 100μm maior que o diâmetro dos postos de carregamento. A gama 200 mM de microcanais conecta esses recursos para uma área de conexão, e será utilizado para lubrificar os posts de carga e cinema cultura.
  2. Fabricar e conectores de títulos para o dispositivo, conforme descrito anteriormente.
  3. Spin-coat uma camada grossa de 10-15 mM PDMS para o lado liso de uma transparência (parâmetros de rotação: 4000 RPM, 120 segundos). Cura a 80 ° C durante pelo menos 4 horas.
  4. Appy vácuo de baixo nível (Barnant Air bomba de aspiração Cadet) para os atuadores, reduzindo o leque de posts.
  5. Plasma tratar e bond o spin filme PDMS revestida para o microdispositivo acionado. Coloque numa placa de aquecimento a 80 ° C por 10 minutos. Os posts e filme hidrofílico cultura permanecerá por um tempo curto.
  6. Preencher os canais de lubrificação com um glicerol 90% em solução de água deionizada. Além de lubrificação, esta formulação mantém a hidrofilicidade do PDMS indefinidamente, reduzindo coeficientes de atrito. Bolhas de ar permanecerá preso entre o poste e cinema cultura. Coloque o aparelho numa placa de aquecimento a 40 ° C, e continuar a injetar lubrificante para dentro do canal, causando um aumento de pressão de pequeno porte. Depois de alguns minutos, as bolhas de ar se difunde através do PDMS, e todas as superfícies serão lubrificados.
  7. Retire a pressão negativa, liberando os postes.
  8. Usando um bisturi, corte em torno do filme PDMS fina. Retire cuidadosamente a transparência afastando o dispositivo.
  9. Plasma bond uma mão cut-PDMS junta em torno da área da cultura dispositivo.
  10. Esterilizar o dispositivo por imersão em etanol 70% por 5 minutos, e depois sob uma luz UV germicida em um armário de segurança biológica por 45 minutos.
  11. Plasma tratar a superfície e incubar com 100 colágeno mcg / mL (ou proteína alternativa ECM) durante a noite a 4 ° C.
  12. Lave o aparelho com tampão fosfato salino (PBS), e células de semente no 10-15000 células / cm 2, dos seguintes protocolos de cultura de células padrão.

Caracterização detalhada da operação microdispositivo e experimentos biológicos realizados com esta plataforma ter sido publicado anteriormente 7.

D. mecanicamente ativo hidrogéis 3D

Modificações para o dispositivo também pode ser usado para ativar a compactação de photopatterned. células-laden, tridimensional hidrogéis de uma forma de alto rendimento. Neste exemplo, nós criamos 350 mM diâmetro polietileno glicol cilindros (PEG) de hidrogel, encapsulando C3H10T1 / 2 mouse células-tronco mesenquimais, e aplicar tensões de compressão que variam de 5 a 25% em todo o array. Este protocolo pode ser usado com mais fotopolimerização químicas avançadas hidrogel. Para usar a plataforma para experimentos em três dimensões mechanobiology (esquema na Figura 4):

Modificações dispositivo:

  1. Revestimento do posts com uma camada grossa de M 1 Parileno-C para reduzir a permeabilidade a gases e melhorar os tempos de polimerização no sistema de hidrogel PEG. Isto reduzirá os efeitos citotóxicos da reação de fotopolimerização radicais livres-based. Pedaços de fita adesiva são usados ​​para mascarar as áreas ao redor do posto, eo dispositivo é revestido em um 2010 LabCoter PDS 2 do sistema (Specialty Coating Systems, Indianapolis, IN, EUA).
  2. O dispositivo revestido é removido do sistema de revestimento, ea fita adesiva descascados, deixando uma camada de conformal Parileno C-ao longo dos posts.
  3. A lamela de vidro é methacrylated 8 por imersão em solução a 2% v / v de 3 - (trimethoxysilyl) propil metacrilato em etanol 95% por 2 minutos.
  4. A lamela é lavado em etanol 100%, e cozido a 100 ° C, deixando grupos metacrilato na superfície.
  5. A 200 mM filme espaçador espessura PDMS é moldado numa placa de Petri, e cortado em pequenos troços. Quatro dessas pequenas seções estão ligadas plasma em torno da borda da lamínula methacrylated.
  6. Os espaçadores são, então, ligado ao plasma-PDMS áreas do dispositivo, abrangendo as mensagens Parileno-C revestida.
  7. Dispositivo é esterilizado por lavagem em etanol 70%, ea exposição à luz UV germicida em um armário de segurança biológica por 45 minutos.

Em polimerização in situ:

Hidrogéis de células carregadas de PEG foram então photolithographically padronizada para o 8,9 dispositivos da seguinte forma:

  1. Prepare a 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio; árabe, AL, EUA) e 10% w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)solução em meios de cultura unsupplmented celular.
  2. Prepare uma solução estoque fotoiniciador de 100 mg / mL de IRGACURE 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, EUA), em 1-vinil-2-pyrolidinone.
  3. Misturar as duas soluções preparadas em conjunto para obter uma solução com uma concentração de 0,4% w / v de fotoiniciador. Filtrar a mistura através de um filtro de seringa 0,45 mM para esterilizar e remover partículas.
  4. Trypsinize culturas de células e preparar uma suspensão de células em meios de cultura, com o dobro da concentração de células desejado ponto final.
  5. Misture a suspensão de células e os filtrados hidrogel solução precursora / fotoiniciador na proporção de 1:1.
  6. Injetar a solução no microdispositivo usando uma agulha longa 25G. Cuidado de evitar bolhas de interceptação no dispositivo.
  7. Alinhar uma máscara de transparência impressa para marcas de alinhamento na superfície do dispositivo. Criar um sistema de iluminação UV para proporcionar uma dose de UV de 17,5 mW / cm 2 na superfície do dispositivo. Iluminar o hidrogel através da máscara de 195 s. Desta vez foi optimizado para o nosso sistema, e pode precisar ser ajustado.
  8. Lavar solução precursora unpolymerized hidrogel com PBS, e substituir o PBS com meios de cultura. Accionar os posts de carregamento para comprimir as construções de hidrogel.

Caracterização detalhada da operação microdispositivo e experimentos biológicos realizados com esta plataforma ter sido publicado anteriormente 10.

E. O equipamento periférico

Modificado pratos petri são usados ​​para manter a esterilidade de culturas de células durante a atuação dos dispositivos. Uma agulha embotado e despojado 18G é epoxied em um buraco perfurado no lado da placa de Petri. Tubulação (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, EUA) é press-montado esses conectores e conecta-se as válvulas solenóides controlados e fonte de pressão.

Pressões para os dispositivos são fornecidos por microbombas externo. Para os experimentos 2D, os valores de pressão positiva 30-55 kPa foram gerados usando uma tensão controlada bomba de diafragma excêntrico (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Alemanha). A modulação por largura de pulso controlador de tensão com base é usado para variar a tensão aplicada ao controle de saída de pressão. Válvulas solenóides e manifolds (S10MM-30-12-3 e MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, EUA) são usados ​​para criar uma onda de pressão cíclica. As válvulas são acionados com um sinal de 12 V, controlado por um gerador de forma de onda quadrada função.

F. caracterização de dispositivos e utilize

Imagem no dispositivo

Um problema comum com as células de imagem ou partículas no dispositivo é a resolução óptica pobres devido à condensação de gotículas abaixo o filme PDMS apoiar a pós-carga. Esta condensação resulta de diferenças de temperatura e umidade dentro da incubadora e após a fixação ou em um estágio do microscópio. Para resolver esse problema:

  1. Conectar um reservatório aberto para a porta de entrada de pressão, e preenchê-lo com água deionizada. Usamos uma seringa aberta com um conector luer lock para maior comodidade.
  2. Coloque o dispositivo e reservatório cheio em uma câmara de vácuo e bomba de baixo.
  3. Espere 5 minutos, e trazer a câmara à pressão atmosférica. Repita duas ou três vezes. Como o ar é deslocado para fora dos canais do aparelho, ela é substituída por água do reservatório, eliminando a gota de condensados ​​e fornecendo um caminho claro para microscopia óptica.
  4. Áreas de imagem usando a cultura de campo claro ou microscopia de fluorescência.

Para imagens de células vivas, este procedimento pode ser feito antes da semeadura das células nos dispositivos. No entanto, os canais devem ser concebidos grande o suficiente para evitar quaisquer perdas viscosa de pressão entre as unidades no dispositivo.

Strain caracterização através do rastreamento do grânulo

Sobre os sistemas de cultura 2D:

  1. Diluir 1 mM contas diâmetro fluorescente (Bangs Laboratories; Fisher, IN) em metanol para a concentração desejada. Diluições de 1:150 a partir das concentrações original (1% de sólidos em solução tampão bead) foram considerados adequados para as nossas necessidades.
  2. Plasma tratar a superfície do dispositivo, e depositar mL 50-10 de suspensão de esferas.
  3. Aguarde até que o metanol para evaporar. Repita se a concentração de talão é muito baixo.
  4. Imagem da célula áreas da cultura, em repouso e sob carga.
  5. Open-source algoritmos de rastreamento automático de partículas pode ser usado em ImageJ (NIH) para acompanhar os deslocamentos do grânulo.
  6. Parâmetros de magnitude de deslocamento, direção e localização podem ser usados ​​em um modelo matemático para caracterizar campos pressão sobre a superfície do dispositivo.

Um procedimento similar pode ser seguido para caracterizar cepas em sistemas 3D. Misture uma quantidade de partículas fluorescentes na hsolução precursora ydrogel. No caso do sistema de hidrogel PEG, os tamanhos dos poros são muito menores do que as do 1 mM contas diâmetro. Grânulos são encapsulados no hidrogel, eo sistema pode ser fotografada usando um microscópio confocal. Deslocamentos esferas pode então ser rastreados, analisados ​​e ajustados a um modelo de deformação.

Resultados G. Representante

Resultados representativos para fabricação de dispositivos, caracterização e operação são fornecidos nas Figuras 5 e 6.

Figura 1
Figura 1. Sandwich processo de fabricação de moldes. (A) Uma transparência é cuidadosamente reduzida em PDMS não curado em um SU-8 master. (B) O sanduíche é colocado em uma pilha de vidro, espuma e metal, e curado em um forno sob compressão. (C) A pilha é desmontado ea transparência descoladas, mantendo o padrão PDMS camada 3. Reproduzido com permissão do Instituto de Física.

Figura 2
Figura 2. Esquemático de micropost verticalmente atuado em (A) de descanso e (B) quando acionado. (C) Esquema do processo de fabricação de multicamadas obrigado a fazer uma série de microposts 3. Adaptado com permissão do Instituto de Física.

Figura 3
Figura 3. Processo para modificar disposição microactuator para conduzir experimentos de células cultivadas em um substrato deformação bidimensional 7. Reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figura 4
Figura 4. Processo para modificar disposição microactuator para realizar experimentos em células cultivadas em tridimensional de hidrogel photopatterned constrói 10. Reproduzido com permissão da Elsevier.

Figura 5
Figura 5. (A) do dispositivo de amostra para cultura mechanostimulatory 2D. Corante vermelho usado para marcar os canais de pressão de atuação, entrega e corante azul usado para marcar os canais de lubrificação. (B) Exemplo de imagem de um experimento de caracterização da estirpe. Manchas vermelhas representam a localização não deformada de contas, enquanto pontos verdes representam os locais deformado 7. Reproduzido com permissão da Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figura 6
Figura 6. (A) do dispositivo de amostra para experimentos de compressão 3D. Corante verde usado para marcar canais de pressão de atuação. (B) Vista de cima para baixo da matriz micropost com (C) construir um hidrogel estampados na parte superior do post. (D, E) Side-reconstruímos imagens do miçangas fluorescentes no hidrogel construto sob (D) de descanso e (E) pressões de atuação 55 kPa, demonstrando o processo de caracterização da estirpe de um sistema de cultura em 3D 10. Reproduzido com permissão da Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Embora conceitualmente simples, a fabricação de dispositivo faz um pouco de habilidade experimental e prática. Particularmente no caso de cultura de células em 2D, o alinhamento das camadas múltiplas em que o dispositivo pode ser desafiador, especialmente sobre uma matriz de grande área. Praticamente falando, nós podemos confiantemente atingir uma taxa de sucesso de 100% de alinhamento usando dispositivos com 50 mm de tolerância do espaçamento entre as características adjacentes em múltiplas camadas. Temos também demonstrou com sucesso o alinhamento com tolerâncias tão baixo quanto 15 mm, mas o tempo necessário alinhamento é substancialmente maior e é alcançado a menor taxa de sucesso. Alinhamento da máscara para biomateriais photopattern para a matriz é igualmente um desafio, mas as mensagens podem ser projetados para ser muito grande em comparação com os cilindros de hidrogel, aliviando essa restrição.

Outros desafios envolvem cultura de células sobre os materiais descritos neste protocolo. No sistema 2D alongamento, usando PDMS como um filme cultura limites investigação biológica para experimentos de curta duração, como a adesão celular ao substrato começa a ser substancialmente afectados após 6 horas de estimulação. Isso pode ser corrigido por covalentemente proteínas da matriz de ligação à superfície PDMS 11, ou através da substituição do PDMS substrato de cultura celular com um material de poliuretano mais clinicamente relevantes, para melhorar a adesão celular e proporcionar maior flexibilidade na conduzidos experimentos biológicos 12. No sistema 3D descrito, a química hidrogel é concebido como um exemplo ilustrativos. Longo prazo cultura de células aderentes requer o uso de hidrogéis alternativa natural ou sintético, ou a inclusão de ligantes na matriz adesiva PEG (que pode ser facilmente conseguido usando químicas PEGylation padrão) 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Reconhecemos o apoio financeiro da Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada e da Canadian Institutes of Health Research (CHRPJ 323533-06), o programa de Bolsas de Pós-Graduação Ontário a CM, e os presidentes do Canadá Pesquisa em Micro e Nano Engenharia de Sistemas de YS, e em Mechanobiology a CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  2. Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
  3. Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
  5. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  6. Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
  7. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
  8. Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
  9. Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  10. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
  11. Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
  12. Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
  13. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats