Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

Published 12/26/2010
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Bioengineering

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Summary

Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans la culture à la fois à deux dimensions et en trois dimensions paradigmes.

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Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

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Abstract

La capacité de la sonde systématiquement in vitro de la réponse cellulaire à des combinaisons de stimuli mécanobiologique pour l'ingénierie tissulaire, la découverte de médicaments ou d'études fondamentales de biologie cellulaire est limitée par les technologies actuelles bioréacteur, qui ne peut pas appliquer simultanément une variété de stimuli mécaniques pour les cellules cultivées. Afin de répondre à cette question, nous avons développé une série de plates-formes conçues pour microfabriqué écran pour les effets des stimuli mécaniques dans un format à haut débit. Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et encore démontrer comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans les deux à deux dimensions et trois paradigmes de la culture dimensionnelle.

Protocol

A. Description de l'appareil et le fonctionnement

Les appareils sont fabriqués en utilisant des multicouches lithographie douce 1 en polydiméthylsiloxane (PDMS), et sont capables de générer simultanément une gamme de conditions mécaniques dans les différents lieux de culture de cellules dans le tableau microfabriqué. Dans ce protocole, les étapes pour fabriquer un tableau de commande pneumatique actionné par microposts sont d'abord décrites, suivi par des mesures pour modifier le dispositif pour permettre la culture mécanique dynamique dans les deux paradigmes en deux dimensions (2D) et en trois dimensions de la culture (3D). L'approche esquissée microfabriqué augmente le débit de plus les systèmes existants macroscopique, et est mieux adapté pour dépister les effets d'une variété de conditions mécaniques.

Le principe de fonctionnement de l'appareil est basé sur un tableau de microposts vertical actionné. Microposts sont fabriqués sur une membrane librement suspendu, et sont soulevées et abaissées par l'application de pressions positives et négatives sous la membrane d'actionnement (figure 1). Une caractéristique clé du tableau est que, en faisant varier la taille de la membrane d'actionnement, une source de pression unique peut être utilisé pour obtenir une gamme de déplacements verticaux à travers le tableau. Ce principe est utilisé pour dépister rapidement la réponse cellulaire à un grand nombre de conditions de stimulation mécanique sur un seul appareil.

Basé sur une conception analogue macroscopique par Schaffer et al. 2, notre conception comporte un deuxième film avec sursis et lubrifié culture cellulaire au cours de la poste, permettant aux cellules de l'expérience déformation du substrat 2D comme les feuillets du film culture sur le poste de chargement élevé. Alternativement, photopatterning un tableau de cellules chargées de hydrogels plus les postes de chargement permet la compression pour la stimulation des cellules en culture 3D. Des instructions détaillées dans la mise en place de ces systèmes suivent.

B. Fabrication du tableau microactionneur pneumatiques

Fabrication du tableau microactionneur pneumatiques nécessite un alignement rigoureux dans les structures multicouches PDMS. Ceci est difficile, en raison du rétrécissement induit des erreurs d'inscription alignement. Pour remédier à cela, nous utilisons un procédé de fabrication appelé «fabrication de moules en sandwich» 3, représenté pour éliminer efficacement cette question 4.

Préparation des matériaux

  1. Simple ou multi-niveau de SU-8 maîtres pour chacun des différents niveaux sont fabriqués dans une salle blanche en utilisant des procédures standard. Pour ces dispositifs, les maîtres sont de 200 à 400 um d'épaisseur, selon l'application. Masters sont hardbaked à 80 ° C pendant trois jours avant utilisation.
  2. Nettoyer les lames de verre et les maîtres SU-8 sont silanisées dans une chambre à vide, pour empêcher l'adhésion de guérir PDMS aux matériaux. Dans une hotte, 60 uL de l'agent de silanisation (tridécafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane (Royaume-Chemical Technologies, Bristol, PA) est à la pipette dans une boîte de Pétri dans la chambre. Le verre nu et SU-8 maîtres sont placés dans la chambre et maintenu sous vide pendant une nuit.
  3. Deux blocs de mousse (disponibles dans les magasins d'alimentation d'artisanat) et un film à jet d'encre généraux de transparence sont coupés à la taille légèrement plus grande que le maître SU-8 utilisée pour la fabrication de moules en sandwich.

Fabrication de moules Sandwich

  1. Chaque couche du dispositif multicouches nécessite une couche de PDMS moulé en utilisant cette méthode. Un schéma du processus de fabrication sandwich au moule est fourni dans la figure 1.
  2. PDMS monomère réticulant et sont bien mélangés dans la norme 10:1. 3 ml de mélange PDMS non durcis sont déposés sur un fabriquée précédemment SU-8 maître, et dégazé dans une chambre à vide.
  3. Le coussin de mousse et de SU-8 maître sont placés sur une plaque de base en plexiglas.
  4. La transparence est soigneusement abaissée sur le PDMS non durci, en veillant à éviter de piéger les bulles d'air. Transparents jet d'encre ont un rugueux et un côté lisse, et il est important que les contacts côté lisse de la non durci PDMS.
  5. Une lame de verre silanisé est placé sur le dessus de la transparence, sous le tapis de mousse deuxième et une plaque supérieure en plexiglas. Le sandwich est alors serrée ensemble à l'aide d'un C-clamp.
  6. Le sandwich PDMS est soigné dans une étuve à 80 ° C pendant au moins 4 heures.
  7. Le sandwich est retiré du four et laisser refroidir avant de retirer la pince.
  8. La pince est enlevée et le sandwich démonté, et les garnitures de mousse sont mis au rebut. La transparence est soigneusement épluché loin de la SU-8 maître, en conservant le film motifs PDMS.
  9. Ces couches motifs PDMS et leurs couches de la transparence de manipulation peuvent ensuite être stockées dans un environnement exempt de poussière jusqu'à ce qu'ils soient prêts à l'emploi. Nous avons utilisé avec succès les couches PDMS jusqu'à deux mois, sans effets délétères notables.

Construire le dispositif multicouches

t "> Le schéma pour la fabrication de la matrice microactionneur est fourni dans la figure 2A, et le fonctionnement des actionneurs est montré dans les figures 2B et C. Pour fabriquer le dispositif:

  1. La plus basse couche de PDMS à motifs est préparé par la fabrication du moule sandwich. Pour ces expériences, motifs circulaires allant de 600 à 1200μm de diamètre ont été utilisées.
  2. La couche de PDMS est ensuite transférée sur une lame de verre propre. Une unité de décharge corona est utilisé pour traiter les surfaces en verre avec PDMS et plasma d'oxygène, et les deux surfaces sont mis en contact les uns avec les autres. La pile est ensuite placé sur une plaque chauffante à 80 ° C pour compléter le processus de collage. La transparence peut alors être décollée et jetée. Pendant ce processus, le film motifs PDMS n'est jamais sorti d'un substrat rigide, empêchant le rétrécissement des couches individuelles.
  3. Selon le succès de l'étape de moulage sandwich, des films minces de PDMS qui n'ont pas été évincés d'entre les SU-8 caractéristiques et la transparence peuvent avoir besoin d'être enlevé. Cela peut être fait manuellement à l'aide d'une aiguille 25G sous un stéréoscope.
  4. La seconde couche sandwich moulé est formé comme un moule négatif de la réplique voulue diaphragme et de la structure de la poste. C'est parce que la fabrication de grande surface SU-8 maîtres est difficile, mais l'utilisation de procédés de fabrication alternative pourrait éliminer cette étape supplémentaire. Dans cette démonstration, circulaires messages 500 um de diamètre ont été utilisées. Le moule négatif est silanisé réplique, et temporairement apposées sur une lame de verre en utilisant un adhésif double face. Non durci PDMS est déposé, dégazé et spin-enduit sur cette couche de moisissures sandwich pour 45 secondes à 1000 tpm, ce qui donne un diaphragme actionnement 60 um d'épaisseur. Le spin-couche de revêtement PDMS est partiellement polymérisé à 80 ° C pendant environ 20 minutes ou jusqu'à ce que le PDMS est collante, mais ne se déforme pas de façon permanente quand on le touche.
  5. La lame de verre et de ruban adhésif double face sont retirés de la couche partiellement guérie PDMS, qui est ensuite traité au plasma, inversé et placé dans un aligneur mesure. L'aligneur est constitué d'un mandrin à vide monté à un micromanipulateur (Siskiyou; Mission Viego, CA, USA). La première couche de PDMS est ensuite traité au plasma et placé sur une scène rotative (Newmark, Grants Pass, OR, USA), sous le mandrin vide, et l'alignement entre les deux couches est observée en utilisant une machine à zoom 12x Navitar système de vision (Navitar; Rochester, NY, USA).
  6. Les couches sont alignées en utilisant le manipulateur, et soigneusement mis en contact. Le sandwich est ensuite retiré de l'alignement, et durci dans un four à 80 ° C pendant encore 30 minutes. La transparence et la réplique de PDMS silanisé moule peut alors être épluchés de l'appareil et mis au rebut. Le dispositif est alors complètement durci à 80 ° C pendant au moins quatre heures.
  7. Selon le type d'expérience menée stimulation mécanique, des couches supplémentaires de PDMS peuvent ensuite être collé à ce dispositif de base en répétant le processus décrit. Détails pour les différents types d'expériences de stimulation mécanique sont fournis dans les sections C et D.

Connecteurs

  1. Une fois que le dispositif est complété, une aiguille peut être utilisée pour effacer la couche de PDMS sur le point de connexion.
  2. Connecteurs commerciales telles que l'Nanoport (Upchurch scientifique; Oak Harbor, WA, USA) peut alors être utilisé pour l'interface avec des tubes externes. Afin d'éviter les exigences de hauteur des connecteurs commerciaux, et donc une utilisation standard des boîtes de Pétri comme récipients appareil, nous fabriquons nos propres comme suit.
  3. Environ 35 g de PDMS est coulé et durci dans un bac de omni-puits (Nunc, Rochester, NY, USA). L'appareil est pelé et coupé en sections petit joint, à partir duquel un 1 / 8 "trou est enlevée à l'aide d'un poinçon.
  4. Une aiguille 18G émoussée est utilisée pour coeur une section du côté de la garniture. Une petite aiguille 21G est utilisée pour enlever le noyau central avant de retirer l'aiguille 18G.
  5. Environ 15g de PDMS est coulé et durci dans un couvercle du bac omni-même, pelées et coupées en section de taille similaire. Cette section est ensuite nettoyé avec du ruban adhésif, de plasma-collé à la partie supérieure du joint, et l'appareil est collé au plasma à l'appareil, côté coup de poing vers le bas.
  6. Une seconde aiguille émoussée 18G est ensuite séparé du connecteur luer plastique coloré, insérée dans le trou évidées et scellé en place avec quelques gouttes de PDMS. Le connecteur résultant est assez efficace, économique et a un volume mort-espace assez grand pour éviter les bulles d'air de pénétrer dans les canaux pendant liquides phases de remplissage.

C. Engin actifs substrats de culture en 2D

Le tableau de microposts actionné peut être utilisé pour créer des profils différents de contrainte dans un film de polymère en suspension, sur lequel les cellules sont cultivées. Augmenter le message dans un film lubrifié entraîne le film à glisser et à se déformer autour du poteau. L'utilisation d'un résultat circulaires après chargement dans une distribution des déformations equibiaxial, mais leconception est polyvalent dans ce message formes différentes peuvent être utilisées pour créer une variété de champs de déformations. Pour modifier le tableau de l'actionneur pour des expériences de culture en 2D (schéma de la figure 3):

  1. Bond une troisième couche de PDMS à l'appareil, comme indiqué dans la figure 3a. La troisième couche de PDMS compose d'une structure à deux couches. Le cercle inférieur correspond à la taille de la cavité sous l'actionnement microposts actionné. Le diamètre du cercle supérieur est supérieure à 100 microns du diamètre des poteaux de chargement. A 200 um microcanaux large relie ces fonctions pour une zone de connexion, et sera utilisée pour lubrifier les postes de chargement et le film de la culture.
  2. Fabriquer et connecteurs liaison à l'appareil, comme décrit précédemment.
  3. Manteau de Spin à 10-15 um d'épaisseur couche de PDMS sur le côté lisse de la transparence (paramètres de spin: 4000 RPM, 120 secondes). Cure à 80 ° C pendant au moins 4 heures.
  4. Appy un vide de bas niveau (Barnant pompe à air d'aspiration des cadets) aux actionneurs, en abaissant le tableau des messages.
  5. Traitement plasma et obligataires le spin pelliculé PDMS à l'microdispositif actionné. Placer sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 10 minutes. Les messages et les films de la culture restera hydrophiles pendant une courte période.
  6. Remplissez les canaux de lubrification avec un glycérol 90% dans une solution d'eau déminéralisée. En plus de la lubrification, cette formulation maintient l'hydrophilie du PDMS indéfiniment, la réduction des coefficients de frottement. Les bulles d'air restera coincé entre le poste et le film de la culture. Placez l'appareil sur une plaque chauffante à 40 ° C, et continuer à injecter du lubrifiant dans le canal, provoquant une augmentation de la pression de petite taille. Après quelques minutes, les bulles d'air se diffuse à travers le PDMS, et toutes les surfaces seront lubrifiés.
  7. Enlever la pression négative, en libérant les postes.
  8. Avec un scalpel, découpez autour de la mince pellicule de PDMS. Retirer délicatement la transparence distances par rapport à l'appareil.
  9. Obligataire plasma d'une main-cut PDMS joint autour de la zone de culture de périphérique.
  10. Stériliser le périphérique par trempage dans de l'éthanol 70% pendant 5 minutes, puis, sous une lumière UV germicide dans une enceinte de sécurité biologique pendant 45 minutes.
  11. Plasma traiter la surface et incuber avec 100 pg / ml de collagène (ou alternatives de protéines ECM) nuit à 4 ° C.
  12. Laver l'appareil avec un tampon phosphate salin (PBS), et les cellules de semences à 10-15000 cellules / cm 2, la suite des protocoles standard de culture cellulaire.

La caractérisation détaillée de l'opération microdispositif et les expériences biologiques réalisées sur cette plateforme ont été publiés ailleurs 7.

D. Engin actifs hydrogels 3D

Modifications de l'appareil peut également être utilisé pour activer la compression des photopatterned. cellule chargée, en trois dimensions des hydrogels de manière à haut débit. Dans cet exemple, nous créons 350 um de diamètre en polyéthylène-glycol cylindres hydrogel (PEG), en encapsulant C3H10T1 / 2 cellules de souris souches mésenchymateuses, et appliquer contraintes de compression allant de 5 à 25% dans le tableau. Ce protocole peut être utilisé avec plus avancés chimies photopolymérisation hydrogel. Pour utiliser la plate-forme pour des expériences en trois dimensions mécanobiologie (schéma de la figure 4):

Modifications périphériques:

  1. Enduire les messages avec une couche de 1 um d'épaisseur du parylène-C pour réduire la perméabilité aux gaz et à améliorer les temps de polymérisation dans le système d'hydrogel PEG. Cela permettra de réduire les effets cytotoxiques de la réaction de photopolymérisation radicale basée libre. Des morceaux de scotch sont utilisés pour masquer les zones autour du poteau, et l'appareil est recouvert d'un PDS 2010 LabCoter deux systèmes (systèmes de revêtement spécialisés; Indianapolis, IN, USA).
  2. Le dispositif d'enduit est retiré du système de revêtement, et le scotch décollé, laissant une couche conforme du parylène-C sur les poteaux.
  3. Une lamelle de verre est méthacrylatée 8 par immersion dans un 2% v / v solution de 3 - (triméthoxysilyl) propyl méthacrylate dans l'éthanol 95% pendant 2 minutes.
  4. La lamelle est rincé à l'éthanol à 100%, et cuit à 100 ° C, laissant des groupes méthacrylate sur la surface.
  5. A 200 um d'épaisseur du film entretoise PDMS est coulé dans une boîte de Pétri, et les couper en petites sections. Quatre de ces petites sections sont collées de plasma autour du bord de la lamelle méthacrylatée.
  6. Les entretoises sont ensuite plasmatique liée à la PDMS-régions de l'appareil, qui couvre les postes parylène-C couché.
  7. L'appareil est stérilisée par un lavage à l'éthanol à 70%, et l'exposition à la lumière UV germicide dans une enceinte de sécurité biologique pendant 45 minutes.

Polymérisation in situ:

Hydrogels PEG-Cell ont ensuite été chargés dans la photolithographie à motifs 8,9 appareils comme suit:

  1. Préparer un 10% p / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio; arabes, AL, USA) et 10% p / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)solution dans unsupplmented milieux de culture cellulaire.
  2. Préparer une solution stock de photoinitiateur de 100 mg / mL d'Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals; Tarrytown, NY, USA) dans la 1-vinyl-2-pyrolidinone.
  3. Bien mélanger les deux solutions préparées ensemble pour obtenir une solution avec une concentration de 0,4% p / v de photoamorceur. Filtrer le mélange à travers un filtre de 0,45 um seringue pour stériliser et éliminer les particules.
  4. Trypsiniser cultures cellulaires et préparer une suspension de cellules dans des milieux de culture, le double de la concentration cellulaire désiré point final.
  5. Mélanger la suspension cellulaire et l'hydrogel filtrée précurseur / photoinitiateur solution dans un rapport 1:1.
  6. Injectez la solution dans le microdispositif utilisant une longue aiguille 25G. Soigneusement éviter de piéger des bulles dans l'appareil.
  7. Aligner un masque de transparence imprimé des marques d'alignement sur la surface du dispositif. Mettre en place un système d'éclairage UV pour fournir une dose d'UV de 17,5 mW / cm 2 à la surface du dispositif. Eclairer l'hydrogel à travers le masque pour 195 s. Cette fois-ci a été optimisé pour notre système, et peut-être besoin d'être ajustée.
  8. Laver solution de précurseur hydrogel non polymérisé avec du PBS, et remplacer le PBS avec les milieux de culture. Actuate les postes de chargement de compresser les constructions d'hydrogel.

La caractérisation détaillée de l'opération microdispositif et les expériences biologiques réalisées sur cette plateforme ont été publiés ailleurs 10.

E. équipements périphériques

Mise à jour des boîtes de Petri sont utilisés pour maintenir la stérilité des cultures de cellules lors de l'actionnement des dispositifs. Une aiguille émoussée et dépouillé 18G l'époxyde un trou percé dans le côté de la boîte de Pétri. Tubes (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, USA) est emmanché à ces connecteurs et se connecte au électrovannes commandées et la source de pression.

Pressions pour les appareils sont fournis par micropompes externes. Pour les expériences en 2D, les valeurs de pression positive de 30 à 55 kPa ont été générés en utilisant une pompe à membrane commandée en tension excentrique (SP 500 EC-LC 4.5Vdc; Schwarzer Precision, Allemagne). Un contrôleur de modulation de largeur de tension base est utilisée pour faire varier la tension appliquée au contrôle de sortie de pression. Electrovannes et les collecteurs (S10MM-30-12-3 et MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) sont utilisés pour créer une onde de pression cyclique. Les soupapes sont actionnées par un signal 12 V, contrôlé par un générateur de fonctions d'onde carrée.

La caractérisation et l'utilisation de périphériques F.

Imagerie de l'appareil

Un problème commun avec les cellules d'imagerie ou de particules sur l'appareil est faible résolution optique due à la condensation des gouttelettes sous le film de PDMS soutenant le poste de chargement. Cette condensation provient des différences de température et d'humidité à l'intérieur de l'incubateur et après fixation ou sur une platine de microscope. Pour résoudre ce problème:

  1. Connectez un réservoir ouvert à l'orifice d'entrée de pression, et le remplir avec de l'eau déminéralisée. Nous utilisons une seringue ouverte avec un connecteur luer lock pour plus de commodité.
  2. Placez l'appareil et le réservoir rempli une chambre à vide et la pompe vers le bas.
  3. Attendez 5 minutes, et amener la chambre à pression atmosphérique. Répétez deux ou trois fois. Comme l'air est déplacé hors des canaux de l'appareil, il est remplacé par l'eau du réservoir, éliminant les condensats des gouttelettes et offrant une voie claire pour la microscopie optique.
  4. Les zones de culture d'image en utilisant le champ lumineux ou microscopie à fluorescence.

Pour l'imagerie des cellules vivantes, cette procédure peut être fait avant l'ensemencement des cellules sur les périphériques. Toutefois, les chaînes doivent être conçus assez grande pour empêcher toute perte de pression visqueuse entre les unités sur l'appareil.

Strain caractérisation par le suivi des perles

Sur les systèmes de culture en 2D:

  1. Diluer 1 pm de diamètre des perles fluorescentes (Bangs Laboratories; Fisher, IN) dans le méthanol à la concentration souhaitée. Les dilutions de 1:150 à partir des concentrations d'origine (les solides de 1% dans une solution tampon billes) ont été trouvés pour être adapté à nos besoins.
  2. Plasma de traiter la surface du dispositif, et le dépôt uL 5-10 de suspension de billes.
  3. Attendez que le méthanol s'évaporer. Répéter l'opération si la concentration cordon est trop faible.
  4. Image de la cellule des zones de culture au repos, et sous la charge.
  5. Open-source automatisé des algorithmes de suivi de particules peuvent ensuite être utilisés dans ImageJ (NIH) pour suivre les déplacements de billes.
  6. Paramètres amplitude de déplacement, l'orientation et l'emplacement peuvent ensuite être utilisés dans un modèle mathématique pour caractériser les champs de déformation sur la surface du dispositif.

Une procédure similaire peut être suivie pour caractériser les souches dans les systèmes 3D. Mélanger une quantité de billes fluorescentes dans la hsolution de précurseur ydrogel. Dans le cas du système d'hydrogel PEG, la taille des pores sont beaucoup plus petits que ceux de l'une des perles um de diamètre. Les perles sont encapsulées dans l'hydrogel, et le système peut être imagée en utilisant un microscope confocal. Déplacements de billes peuvent ensuite être suivis, analysés et montés sur un modèle de déformation.

G. résultats représentatifs

Les résultats représentatifs pour la fabrication de dispositifs, de caractérisation et d'exploitation sont fournies dans les figures 5 et 6.

Figure 1
Figure 1. Processus de fabrication du sandwich moule. (A) Un rétroprojecteur est soigneusement abaissée sur affinés PDMS sur un SU-8 maître. (B) Le sandwich est placé dans une pile de mousse, verre et métal, et durci dans un four sous compression. (C) La pile est démontée et la transparence décollée, en conservant les motifs PDMS couche 3. Reproduit avec la permission de l'Institut de Physique.

Figure 2
Figure 2. Schéma de microtiges vertical actionné à (A) de repos et de (B) lorsqu'il est actionné. (C) Schéma du processus de fabrication multicouches nécessaire de faire un tableau de microposts 3. Adapté avec la permission de l'Institut de Physique.

Figure 3
Figure 3. Processus de modifier array microactionneur de mener des expériences pour les cellules cultivées sur une déformation de deux dimensions substrat 7. Reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figure 4
Figure 4. Processus de modifier array microactionneur de mener des expériences pour les cellules cultivées en trois dimensions des constructions photopatterned hydrogel 10. Reproduit avec la permission d'Elsevier.

Figure 5
Figure 5. Périphérique échantillon (A) pour la culture mechanostimulatory 2D. Colorant rouge utilisé pour marquer les canaux de livraison actionnement de pression, et du colorant bleu utilisé pour marquer les canaux de lubrification. Echantillon (B) d'une expérience de caractérisation des souches. Des taches rouges représentent l'emplacement non déformé des perles, tandis que des taches vertes représentent les emplacements déformés 7. Reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figure 6
Figure 6. Exemple de dispositif de (A) pour la 3D expériences de compression. Vert colorant utilisé pour marquer les canaux pression de commande. (B) de haut en bas de tableau Vue microtiges avec (C) de construire un hydrogel motifs sur le dessus du poste. (D, E) Side-reconstruit les images de billes fluorescentes dans l'hydrogel de construire sous (D) le repos et (E) les pressions actionnement 55 kPa, ce qui démontre le processus de caractérisation de la souche dans un système de culture 3D 10. Reproduit avec la permission d'Elsevier.

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Discussion

Bien que conceptuellement simple, la fabrication de dispositifs ne prennent une certaine habileté expérimentale et pratique. Particulièrement dans le cas de la culture cellulaire 2D, l'alignement des couches multiples dans l'appareil peut être difficile, surtout sur un large éventail de la région. Pratiquement parlant, nous pouvons atteindre un taux de fiabilité de 100% de succès d'alignement utilisant des dispositifs avec 50 um de tolérance dans l'espacement entre les éléments adjacents en couches multiples. Nous avons également démontré avec succès l'alignement avec des tolérances aussi bas que 15 pm, mais le temps d'alignement requis est nettement supérieure et est réalisée à un taux de réussite inférieur. Alignement du masque aux biomatériaux photopattern sur le tableau est similaire difficile, mais les messages peuvent être conçus pour être assez importante en comparaison avec les bouteilles d'hydrogel, alléger cette contrainte.

D'autres défis impliquent la culture de cellules sur les matériaux décrits dans le présent protocole. Dans le système 2D qui s'étend, en utilisant le PDMS comme un film de culture limites investigation biologique à court terme des expériences, que l'adhérence cellulaire au substrat commence à être substantiellement affectée après 6 heures de stimulation. Ceci peut être corrigé par covalence protéines de la matrice liant à la surface de PDMS 11, ou en remplaçant le substrat de culture cellulaire avec PDMS un matériau polyuréthane cliniquement plus pertinent, pour améliorer l'adhérence des cellules et de fournir une plus grande souplesse dans la conduite des expériences biologiques 12. Dans le système décrit 3D, la chimie hydrogel est conçu comme un exemple d'illustration. À long terme la culture de cellules adhérentes nécessite l'utilisation d'alternatives hydrogels naturels ou synthétiques, ou l'inclusion de ligands d'adhésion dans la matrice PEG (qui peut être facilement réalisé en utilisant la norme chimies PEGylation) 13.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous reconnaissons l'appui financier de sciences naturelles et en génie du Canada et les Instituts canadiens de recherche en santé (CHRPJ 323533-06), le programme Bourses d'études supérieures de l'Ontario à la CM, et le Programme des chaires de recherche en micro et nano systèmes d'ingénierie à YS, et dans mécanobiologie devant le TAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

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    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

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