Author Produced

تسليم الجينات إلى الدماغ الجرذ بعد الولادة من غير البطين حقن البلازميد وElectroporation

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هذا البروتوكول يصف أسلوب غير الفيروسية تسليم يبني الجينية لمنطقة معينة من الدماغ القوارض الحية. الأسلوب يتكون من إعداد البلازميد وتصنيع micropipette ، جراحة الأطفال حديثي الولادة الفئران الجرو ، microinjection للبناء ، و

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

خلق حيوانات معدلة وراثيا هو مقاربة نموذجية في دراسة وظائف الجينات ذات الأهمية في الجسم الحي. ومع ذلك ، العديد من خروج المغلوب أو حيوانات معدلة وراثيا ليست قابلة للحياة في تلك الحالات حيث يتم التعبير عن الجينات في تعديل أو حذف الكائن الحي كله. علاوة على ذلك ، مجموعة متنوعة من الآليات التعويضية غالبا ما تجعل من الصعب تفسير النتائج. ويمكن التخفيف من آثار التعويضية إما توقيت التعبير الجيني أو الحد من كمية الخلايا transfected.

طريقة microinjection غير البطين بعد الولادة ويسمح في فيفو electroporation التسليم الموجه للجينات ، أو جزيئات سيرنا صبغة مباشرة إلى منطقة صغيرة من الفائدة في الدماغ القوارض الوليد. على النقيض من البطين التقليدية تقنية الحقن ، وهذا الأسلوب يسمح ترنسفكأيشن من أنواع الخلايا غير المهاجرة. ويمكن استخدام الحيوانات transfected عن طريق الأسلوب الموصوفة هنا ، على سبيل المثال ، لفوتون اثنين في التصوير أو في التجارب المجراة على شرائح الكهربية في الدماغ الحادة.

Protocol

1. مقدمة

خلق حيوانات معدلة وراثيا هو وسيلة قوية لتحقيق وظائف الجينات في الحيوانات الحية (1) وكشف عن آلية المرض 2،3 فضلا عن التلاعب خصائص الخلايا 4. ومع ذلك ، فإن الإجراء هو شاقة نوعا ما ، الوقت طويلا ومكلفا للغاية ، ويستدعي بالتالي استخدام الطرق البديلة لتوصيل الجينات الفيروسية مثل حقن 5 ، الولدان الحقن البطيني مع electroporation 6 و 7،8 في الرحم electroporation. طريقة الحقن غير البطين بعد الولادة وelectroporation لديه مجموعة فريدة من المزايا : استخدام غير الفيروسية يبني الجينية ؛ إمكانية لخلق نمط التعبير المحلية في مجال الاهتمام ، في الموضع ترنسفكأيشن من أنواع الخلايا غير المهاجرة ، على سبيل المثال القشرية النجمية.

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح مفصل لإجراءات توصيل الجينات إلى الدماغ بعد الولادة الفئران حديثي الولادة باستخدام بلازميد ترميز للبروتين الفلورية الخضراء في إطار تعزيز المروج الدجاج أكتين بيتا مع محسن CMV (pCAG - EGFP) 9. نحن لتوضيح إعداد الحل الحقن التي تحتوي على البلازميد ، تصنيع ماصات زجاجية رقيقة وتجميع microinjector على صك المجسم. ثم نتحدث عن anaesthetizing الفئران الوليدة مع isoflurane ، حول كيفية تنفيذ العملية ، حول إجراء الحقن وحول electroporation باستخدام الملقط الأقطاب وporator في الجسم الحي. أخيرا ، نحن نناقش بإيجاز النتائج المتوقعة ، وجهات النظر والصعوبات التي قد تنشأ خلال هذه التجارب.

2. البلازميد التحضير لElectroporation

  1. نحن نستعد عادة 10 ميكرولتر من الحل في حقن البلازميد 200 ميكرولتر أنبوب جدار رقيق. هذا الحل هو ما يكفي لتجارب عدة.
  2. نحن مزيج 8 ميكرولتر من الحل البلازميد (انظر المواد والمعدات) مع 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10X (انظر المواد والمعدات) و 1 ميكرولتر من 0،1 ٪ حل سريع المياه الخضراء (انظر المواد والمعدات).
  3. وينبغي التركيز النهائي للبلازميد في حل الحقن ما بين 1 و 3 ميكروغرام / ميكرولتر. وتركيزات أقل من الحمض النووي البلازميد تقليل كفاءة ترنسفكأيشن ، في حين أن أعلى تركيز الحمض النووي سيكون لزجة جدا للحقن عن طريق التلميح رقيقة من الزجاج الشعرية.

3. الزجاج الإبرة التحضير

  1. لإعداد ماصة الزجاج ، ونحن نستخدم الزجاج البورسليكات الشعرية مع خيوط (انظر المواد والمعدات) والزجاج الكهربائي العمودي مجتذب (انظر المواد والمعدات) على أقصى سحب والتدفئة المعلمات.
  2. ثم نكسر غيض من ماصة باستخدام قطعة من الورق لتحقيق غيض 10-20 ميكرون في القطر.
  3. علينا التحقق من قطر الحافة والشكل تحت المجهر الهدف.

4. Microinjector تجميع

  1. باستخدام البوليمر رقيقة الشعرية (انظر المواد والمعدات) ونحن ملء ما يقرب من 1 / 3 من حجم حقنة هاميلتون 10 ميكرولتر (انظر المواد والمعدات) مع الزيوت المعدنية (انظر المواد والمعدات). تجنب فقاعات الهواء!
  2. ثم ملأنا ماصة الزجاج مع الزيوت المعدنية وتضاف الى ماصة المحقنة هاملتون. تجنب فقاعات الهواء!
  3. ثم يتم إصلاح المحاقن مع ماصة الزجاج على microinjector متصلا إلى وحدة تحكم (انظر المواد والمعدات).
  4. الإعداد microinjection الثابتة على صك المجسم (انظر المواد والمعدات) يسمح لنا أن تزج بأمان غيض من ماصة الزجاج داخل الأنبوب مع محلول الحقن البلازميد.
  5. عندما يلامس سطح غيض من الحل ، وتراجع أنه ملم مزيدا من 1 أو 2 وملء ماصة مع ما يقرب من 1 ميكرولتر من مزيج الحقن باستخدام محقنة الدقيقة تحكم.

5. Anaesthetizing الحيوانية

تم تنفيذ جميع الإجراءات المقدمة هنا وفقا للوائح جامعة هلسنكي للتجارب على الحيوانات.

  1. لكل تجربة ، ونحن ملء محقنة الغاز محكم (انظر المواد والمعدات) مع ما يقرب من 2 مل من isoflurane (انظر المواد والمعدات).
  2. مما هو ثابت في وحدة حقنة تخدير (انظر المواد والمعدات) متصلا تدفق الهواء مصدر ، مربع الحيوانية وقناع الثابتة على إعداد المجسم.
  3. على وحدة التخدير ، وعلينا أن نعدل تدفق الهواء الى 250 تقريبا مل / دقيقة وعلى مستوى isoflurane إلى 4 ٪.
  4. نضع الفئران الجرو في خانة الحيوان لمدة 2-5 دقائق.
  5. عندما يتوقف تحريك الجرو ، وضعه على لوحة التدفئة (انظر المواد والمعدات) التي تعلق على إعداد المجسم.
  6. المكان جزء منقاري رأس الجرو حيز قناع anaesthetizing.
  7. يستغرق 5 إلى 10 دقائق لالجرو للدخول في التخدير العميق.
  8. التحقق من عمق التخدير مع قليل الذيل وانخفاض تدفق isoflurane إلى حوالي 1.5 إلى 2.0 ٪.

6. عملية جراحية ، وMicroinjection Electroporation

  1. علاج الجلد على رأس الجرو مع الايثانول 70 ٪.
  2. باستخدام مقص صغير (انظر المواد والمعدات) وملقط رقيقة (انظر المواد والمعدات) ، وقطع الجلد من القفا من الجرو على جبهته.
  3. ينحني قطعة الجلد وسحب قضبان جانبية طفيفة في الأذن الفوهات أذني من الجمجمة لتثبيت الرأس والجلد.
  4. باستخدام مجهر مجهر ، ونحن تحديد موقع نقطة bregma على الجمجمة.
  5. تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام إحداثيات المجسم.
  6. موقف ماصة الحقن فوق هذه المنطقة وعلامة عليه من خلال إسقاط 25-50 NL من الحل الحقن على سطح الجمجمة.
  7. حفر الجمجمة برفق وعناية في نقطة تميز باستخدام الحفر بسرعة عالية الجراحية (انظر المواد والمعدات) تحت المجهر حتى يظهر السائل في منطقة حفر.
  8. يحدد للelectropotation ملقط أقطاب (انظر المواد والمعدات) على الجانبين من الجمجمة مع جل موصل الحالية (انظر مواد ومعدات) لتحقيق أفضل الموصلية.
  9. إزالة قطرة السائل من حفر حفرة صغيرة باستخدام الصمام (انظر المواد والمعدات) وتراجع الإبرة لثقب الزجاج وفقا لإحداثيات موقع الحقن.
  10. يبث 25-100 NL من الحل الحقن بمعدل من 5 إلى 20 NL / ثانية.
  11. إزالة بسرعة وماصة electroporate على الفور. ويتم ذلك عن طريق تطبيق Electroporation البقول المستطيل خمس سنوات مع مدة 50 مللي ثانية والسعة من 99 في الخامس من التردد 1 هرتز.
  12. إزالة الأقطاب الكهربائية وقضبان الأذن.
  13. خياطة الجلد خفض استخدام مزيج من ملقط البكم (انظر المواد والمعدات) وحاد والمواضيع الجراحية (انظر المواد والمعدات).
  14. ضع الجرو الى غرفة دافئة ل15-30 دقيقة للمساعدة انتعاشها بعد التخدير.
  15. ثم وضع الظهر الجرو قفص لأمه.

7. ممثل النتائج

والتعبير عن التحوير في الخلايا transfected بنجاح تظهر ما يقرب من 10 ساعة بعد electroporation ، وسوف تبقى مستقرة لعدة أسابيع.

microinjected نحن البلازميد إما في طبقات عميقة القشرية أو منطقة المخطط من اليوم بعد الولادة 2 (P2) الفئران الوليدة ويستار أجريت في electroporation المجراة على النحو المبين أعلاه. وقطعت شرائح الدماغ (400 ميكرومتر في السمك) بعد 2 إلى 6 أيام (P4 - P8) باستخدام vibrotome في البرد المتوسطة تشريح (Hepes مخزنة في محلول الملح المتوازن ايرلي) 10. تم تنفيذ الحصول على الصور باستخدام زايس Axioplan 2 LSM5 المجهر مبائر باسكال (زايس ، وألمانيا) في المتوسط ​​تشريح في درجة حرارة الغرفة.

يرد مواقع الحقن في طبقات عميقة وقشري الخلايا المخطط transfected هؤلاء الذين يعربون عن EGFP التي كانت موجودة في المنطقة المدمجة حوالي 200-300 ميكرون في القطر (الشكل 1A ، B). transfected داخل الخلايا ، ومستوى التعبير EGFP عالية بما فيه الكفاية للسماح للتصوير العمليات الخلوية رقيقة (الشكل 1C) بما في ذلك العمود الفقري مع التشعبات من الأشكال المختلفة (الشكل 1D) وحزم محوار (الشكل 1E). سمح للاستقرار قوية من EGFP كذلك بقاء الخلية بعد electroporation تتبع أجزاء البعيدة من محاور (حتى 1،5-2 ملم من الهيئات الخلية) مثل محطات القشرية (الشكل 1F).

الشكل 1
الشكل 1 (أ) transfected بنجاح الخلايا في منطقة من الدماغ المخطط الفئران P4 ترسيم البلازميد موقع الحقن. (ب) Transfected الخلايا في الطبقات العميقة القشرية (حوالي 1000 ميكرومتر تحت سطح القشرة) من دماغ الفئران P5. (C) خلية transfected في منطقة من الدماغ المخطط الفئران P8. (د) عمليات شجيري خلية transfected في منطقة من الدماغ المخطط الفئران P8 ؛ السهام تشير أنواع مختلفة من أشواك الشجيرية وأرجل كاذبة خيطية. (E) محاور عصبية من الخلايا transfected داخل الممر الجانبي. (F) محاور عصبية تنتهي عند سطح القشرة من الفئران حنوني P8 (رأس السهم). أشرطة النطاق هي 100 ميكرومتر على A ، E ، B و F ، و 10 ميكرومتر على جيم ودال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هي راسخة طرق توصيل الجينات في الدماغ القوارض الذين يعيشون في الرحم لelectroporation 7،8،11،12 ، وفي الآونة الأخيرة ، لelectroporation بعد الولادة 6. ومع ذلك ، تعتمد هذه الأساليب على الحقن داخل البطيني من الحمض النووي البلازميد ، والتي قد يحد من العديد من التطبيقات. على سبيل المثال ، فإن هذه الأساليب لا يسمح باستهداف خلايا الدماغ في مناطق معينة مثل الحصين ، ولا من هذا القبيل ترنسفكأيشن أنواع الخلايا غير المهاجرة كما النجمية القشرية. وقد استخدم لأول مرة غير البطين حقن مقرونا electroporation لإيصال الجين إلى الخلايا العصبية للدماغ 13. بروتوكول ملحق يوضح لنا غير البطين طريقة لمناطق أخرى من الدماغ الفئران. نقترح أن نهجنا المنهجية هو بديل لطرق مفيدة لتوصيل الجينات الفيروسية إلى المناطق المحظورة المصالح داخل دماغ الفئران بعد الولادة 5.

على الرغم من مزايا الطريقة الحالية ، قد يكون من المتوقع حدوث بعض الصعوبات التي نوقشت على النحو المبين أدناه.

1.Optimal عمر الحيوان

عندما يكون ذلك ممكنا ، ينبغي أن أصغر أنواع الجرذان الولدان يكون استخدامها ، كوسيلة لزيادة فعالية كل من ترنسفكأيشن الجرو والبقاء بعد الجراحة. في أيدينا ، والجراء P0 صغيرة جدا لأنه من الصعب أن الهدف بتكاثر منطقة معينة في الدماغ باستخدام المجسم الإحداثيات التي تم الحصول عليها من أطلس الدماغ المتاحة لهذا سن 14. بالإضافة إلى ذلك ، الجراء P0 كانت بشرتك رقيقة والعطاء التي قد تعوق الخياطة. وP3 و P4 هي الأكثر ملاءمة من حيث المعالجات الجراحية والمجسم بالمقارنة مع P0 - P2 الحيوانات ، ولكن لديهم فرط الحساسية للتخدير isoflurane التي قد تسبب نوبات انقطاع التنفس أثناء والجراحة. وبالتالي ، فإن أفضل خيار هو الفئران الوليدة P1 - P2 التي يمكن التنبؤ بها خلال عملية جراحية واسعة بما يكفي لmicroinjections استنساخه.

2.Possible مشاكل مع microinjection

عندما يتم حقن كميات صغيرة من محلول (25-100 NL) من خلال طرف زجاج رقيق إلى أنسجة المخ يمارس ضغط المعارضة ، فمن الأهمية بمكان أن يتم تجنب بعناية فقاعات الهواء أو التسرب. قد فشل في تجنب هذه تتسبب في تراجع كبير في كفاءة ترنسفكأيشن.

احداثيات الحدود 3.Precision المجسم

على الرغم من دقة إحداثيات المجسم ، لديهم الحد في استنساخ 0.3 ملم 15. في تجربتنا باستخدام حيوانات من نفس العمر والوزن فمن المحتمل أن ينخفض ​​هذا الحد إلى 0،2-0،1 مم وهو ما يكفي لاستهداف استنساخه في منطقة قرن آمون CA1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نشكر ايكاترينا Karelina للمساعدة في تسجيل الموسيقى التصويرية للفيديو ، إيفان Molotkov للرسوم المتحركة 3D ، والدكتور بيتر لBlaesse CAG - EGFP إعداد البلازميد.

وأيد العمل من المنح المقدمة من مركز الحراك الدولي في فنلندا ، ومؤسسة الثقافة الفنلندية وأكاديمية فنلندا.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
  2. McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
  3. Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
  4. Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
  6. Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
  7. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  8. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
  10. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  11. Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  12. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  13. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
  14. Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. 3rd edition, Academic Press. (2008).
  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics