Author Produced

Гена Доставка в послеродовой мозга крысы по Non-желудочковой плазмиды инъекция и Электропорация

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол описывает невирусных способ доставки генетических конструкций в определенной области живой мозг грызуна. Метод состоит из плазмиды подготовки, микропипетки изготовления, новорожденных крысят хирургии, микроинъекции построить, и

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Создание трансгенных животных является стандартным подходом в изучении функции гена в живом организме. Однако многие нокаутом или трансгенных животных, не являются жизнеспособными в тех случаях, когда изменение ген экспрессируется или удалены во всем организме. Более того, различные компенсаторные механизмы часто затрудняют интерпретацию результатов. Компенсационных эффектов можно избежать, либо сроках экспрессии генов или ограничение количества трансфекции клеток.

Метод постнатального не-желудочковой микроинъекции и в естественных условиях электропорация позволяет адресной доставки генов, миРНК или молекул красителя непосредственно в небольшой области интереса к новорожденному мозга грызунов. В отличие от обычной техники инъекции желудочка, этот метод позволяет трансфекции немигрирующих типов клеток. Животные трансфекции с помощью метода, описанного здесь, может использоваться, например, для двухфотонного в естественных изображений или в электрофизиологических экспериментах на острые ломтики мозга.

Protocol

1. Введение

Создание трансгенных животных является мощным методом исследования функции генов в живых животных 1 и для распутывания болезнь механизм 2,3, а также для управления свойства клеток 4. Тем не менее, процедура довольно трудоемкая, чрезвычайно трудоемким и дорогим, таким образом, требующие использования альтернативных методов доставки генов, таких как вирусные инъекций 5, неонатальной инъекции желудочка с электропорации 6 и внутриутробно электропорации 7,8. Метод постнатального не-желудочковой инъекции и электропорации имеет уникальный набор преимуществ: использование невирусных генетических конструкций; возможность создания местных выражению в области интересов; на месте трансфекции немигрирующих типы клеток, например, корковый астроцитов.

В этом видео, мы демонстрируем детальную процедуру постнатального доставки генов в неонатальном мозге крыс использованием плазмиды, кодирующей для расширения зеленого флуоресцентного белка в куриной бета-актин промотора CMV усилителя (pCAG-EGFP) 9. Проиллюстрируем подготовка плазмид-содержащих раствор для инъекций, изготовление тонких стеклянных пипеток и монтаж microinjector на стереотаксической инструмента. Тогда мы говорим о обезболивающее крысят с изофлуран, о выполнении операции, о процедуре инъекции и около электропорации использованием щипцов электродов и в porator естественных условиях. Наконец, мы кратко рассмотрим ожидаемые результаты, перспективы и трудности, которые могут возникнуть в ходе этих экспериментов.

2. Плазмиды Подготовка к Электропорация

  1. Мы обычно готовят 10 мкл плазмиды инъекционного раствора в 200 мкл тонкие стенки трубы. Это решение вполне достаточно для нескольких экспериментов.
  2. Мы смешиваем 8 мкл плазмиды решения (см. материалы и оборудование) с 1 мкл 10X PBS (см. Материалы и оборудование) и 1 мкл 0,1% Быстрый зеленый водного раствора (см. Материалы и оборудование).
  3. Конечной концентрации плазмиды в раствор для инъекций должно быть от 1 до 3 мкг / мкл. Более низкие концентрации плазмидной ДНК снизит эффективность трансфекции, в то время как высшие концентрации ДНК будет слишком вязким для инъекций через тонкий кончик стеклянный капилляр.

3. Стекло иглы подготовка

  1. Для приготовления пипетки стекла, мы используем боросиликатного стеклянный капилляр с нитью (см. Материалы и оборудование) и вертикальной съемник стеклянный электрод (см. Материалы и оборудование) на максимальное тяговое и отопления параметров.
  2. Затем перерыв кончика пипетки использованием листа бумаги для достижения кончика 10-20 мкм в диаметре.
  3. Мы проверяем диаметр кончика и форму под микроскопом цели.

4. Сборка Microinjector

  1. Использование тонких полимерных капиллярные (см. Материалы и оборудование), мы заполняем примерно 1 / 3 объема 10 мкл Hamilton шприца (см. Материалы и оборудование) с минеральным маслом (см. Материалы и оборудование). Избегайте воздушных пузырьков!
  2. Затем мы заполняем стеклянную пипетку с минеральным маслом и вставьте пипетки в шприце Hamilton. Избегайте воздушных пузырьков!
  3. Шприц со стеклянной пипетки, затем фиксируется на microinjector подключены к контроллеру (см. Материалы и оборудование).
  4. Микроинъекции установки закреплены на стереотаксической документа (см. Материалы и оборудование) позволяет безопасно погрузить кончик стеклянной пипетки в пробирку с плазмидой инъекционного раствора.
  5. Когда наконечник касается поверхности решение, окуните его дальше, 1 или 2 мм и заполнить пипетку с приблизительно 1 мкл инъекции смеси использованием микро инжектор контроллер.

5. Обезболивающее животных

Все процедуры, представленные здесь, были выполнены в соответствии с Хельсинкским университетом правила для экспериментов на животных.

  1. Для каждого эксперимента, мы заполняем газонепроницаемый шприц (см. Материалы и оборудование) с приблизительно 2 мл изофлуран (см. Материалы и оборудование).
  2. Чем шприца закреплен на анестезию блока (см. Материалы и оборудование), подключенного к источнику воздушного потока, коробка животных и маски фиксируется на стереотаксической установки.
  3. На наркоз блок, мы регулируем поток воздуха примерно до 250 мл / мин и изофлуран уровне до 4%.
  4. Мы размещаем крысят в окне животное в течение 2-5 минут.
  5. Когда щенок перестает двигаться, поместите его на грелку (см. Материалы и оборудование), подключенных к стереотаксической установки.
  6. Место ростральной части щенка головой в обезболивающее маску.
  7. Это занимает от 5 до 10 минутщенка, чтобы войти в глубокий наркоз.
  8. Проверьте глубину анестезии с хвостом шнура и уменьшения изофлуран приток около 1,5 до 2,0%.

6. Хирургия, Микроинъекция и Электропорация

  1. Лечите кожу на голове щенка с 70% этанола.
  2. Используя небольшие ножницы (см. Материалы и оборудование) и тонких щипцов (см. Материалы и оборудование), вырезать кожу от шиворот щенка к его лбу.
  3. Бенд кожу части вбок и потяните ухо баров немного в звуковые отверстия черепа для головы и кожи фиксации.
  4. Использование бинокулярный микроскоп, мы располагаем брегмы точку на черепе.
  5. Определите область интереса использованием стереотаксической координат.
  6. Позиция инъекции пипетки над этим регионом и отметьте его, понижая 25-50 п от инъекционного раствора на поверхности черепа.
  7. Дрель череп мягко и внимательно на отмеченные точки, используя высокую скорость хирургические сверла (см. Материалы и оборудование) под микроскопом, пока жидкость появляется в пробуренные области.
  8. Fix electropotation щипцы электродами (см. Материалы и оборудование), по бокам черепа с текущей гель проводящих (см. Материалы и оборудование) для достижения лучшей проводимости.
  9. Удалите капли жидкости из отверстия с помощью небольших тампоном (см. Материалы и оборудование) и опустите стекло иглой отверстие в соответствии с координатами места инъекции.
  10. Настаивать 25 до 100 п от раствор для инъекций в размере от 5 до 20 л / сек.
  11. Быстро удалить пипеткой и electroporate немедленно. Электропорация осуществляется путем применения пяти импульсов прямоугольник с длительностью 50 мс и амплитудой до 99 В при частоте 1 Гц.
  12. Удалите электроды и ухо баров.
  13. Шить порезаться, используя комбинацию немой (см. Материалы и оборудование) и резкое щипцов и хирургических нитей (см. Материалы и оборудование).
  14. Место щенка в теплой камере в течение 15-30 минут, чтобы помочь ее восстановлению после наркоза.
  15. Затем положить щенка обратно в клетку его матери.

7. Представитель Результаты

Выражение трансгена в успешной трансфекции клетки появятся примерно через 10 часов после электропорации, и она будет оставаться стабильной в течение нескольких недель.

Мы microinjected плазмиды либо в глубоких слоях коры или стриатума области послеродового день 2 (P2) щенков Wistar крысах и выступал в живом электропорации как описано выше. Мозг ломтиками (400 мкм в толщину) были сокращены после 2 до 6 дней (P4-P8) с использованием vibrotome в холодной нарезки среды (Hepes буфер сбалансированный солевой раствор Эрла) 10. Image Acquisition проводили с использованием Zeiss Axioplan 2 LSM5 Паскаль конфокальной микроскопии (Zeiss, Германия) в нарезка среде при комнатной температуре.

Инъекций в глубоких слоях коры и полосатого тела содержится много трансфекции клеток, экспрессирующих EGFP которые были расположены в компактной области около 200-300 мкм в диаметре (рис. 1а, б). В трансфекции клеток, уровень EGFP выражении достаточно высока, чтобы изображение тонких клеточных процессов (рис. 1C), включая дендриты с шипами различной формы (рис. 1D) и пучки аксонов (рис. 1E). Робастной устойчивости EGFP, а также жизнеспособность клеток после электропорации позволили отслеживания дистальной части аксонов (до 1,5-2 мм от клеточных тел), таких как корковые терминалов (рис. 1F).

Рисунок 1
Рисунок 1. () Успешно трансфекции клеток в области полосатого тела мозга крысы P4 разграничения плазмиды месте инъекции. (B) трансфицированных клеток в глубоких слоях коры (около 1000 мкм ниже поверхности коры) мозга крысы P5. (C) трансфицированных ячейку в области полосатого тела мозга крысы P8. (D) Дендритные процессы трансфицированных ячейку в области полосатого тела мозга крысы P8; стрелки указывают различные типы дендритных шипиков и филоподий. (Е) Аксоны трансфекции клеток в залог пути. (F) Аксоны заканчиваются на пиальных поверхности P8 крысы коры (стрелки). Шкала бары 100 мкм, B, E и F, 10 мкм на С и D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы доставки генов в живой мозг грызуна, хорошо известны за внутриутробно электропорации 7,8,11,12 и, совсем недавно, в послеродовом электропорации 6. Однако, эти методы основаны на внутрижелудочкового введения плазмидной ДНК, которые могут быть предельными для нескольких приложений. Например, эти методы не позволяют ориентации клеток в определенных областях мозга, таких как гиппокамп, ни трансфекции таких немигрирующих типов клеток, как корковых астроцитов. Номера для инъекций желудочка в сочетании с электропорации был впервые использован для доставки генов в нейронах мозжечка 13. Наш протокол иллюстрирует расширение желудочков, не метод для других регионов мозга крыс. Мы полагаем, что наш методологический подход полезная альтернатива вирусные методы доставки генов в запретные зоны интересов в послеродовом мозга крысы 5.

Несмотря на преимущества данного метода, некоторые трудности, можно ожидать, как описано ниже.

1.Optimal возраст животного

Когда это возможно, младший новорожденных крысят должны использовать, как средство повышения эффективности трансфекции как и щенок выживание после операции. В наших руках, P0 щенков слишком малы, как трудно целевой воспроизводимо в определенной области мозга с помощью стереотаксической координат получена из атласа мозга для этого возраста 14. Кроме того, P0 щенков имеют тонкую и нежную кожу, что может препятствовать шитья. P3 и P4 наиболее удобны с точки зрения хирургического и стереотаксической манипуляции по сравнению с Р0-P2 животных, но у них есть повышенная чувствительность к изофлуран анестезии, которые могут вызвать судороги и дыхание перерывы во время операции. Таким образом, лучшим вариантом является P1-P2 крысят, которые предсказуемы во время операции и достаточно большой для воспроизводимых микроинъекций.

2.Possible проблемы с микроинъекции

При небольших объемах раствора (25-100 с.ш.) вводят через тонкий кончик стекла для тканей мозга оказывает противоположные давление, очень важно, чтобы пузырьки воздуха или утечек тщательно избегать. Неспособность, чтобы избежать этих может привести к резкому снижению эффективности трансфекции.

3.Precision ограничения для стереотаксической координаты

Несмотря на точность стереотаксической координат, у них есть лимит на 0,3 мм воспроизводимость 15. По нашему опыту использования животных того же возраста и веса можно уменьшить этот предел до 0,2-0,1 мм, что является достаточным для воспроизводимых адресности СА1 гиппокампа области.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Мы благодарим Екатерина Карелина на помощь с саундтреком для записи видео, Иван Молотков для 3D-анимации и д-р Питер Blaesse для CAG-EGFP плазмидной ДНК.

Работа выполнена при поддержке грантов от центра международной мобильности Финляндии, финский культурный фонд и Академия Финляндии.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
  2. McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
  3. Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
  4. Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
  6. Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
  7. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  8. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
  10. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  11. Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  12. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  13. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
  14. Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. 3rd edition, Academic Press. (2008).
  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics