Gen de entrega de cerebro de rata postnatal por la inyección no ventricular plásmido y electroporación

Neuroscience

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Summary

Este protocolo describe un método no viral de la entrega de las construcciones genéticas en un área determinada del cerebro de roedor viviente. El método consiste en la preparación de plásmidos, fabricación micropipeta, la cirugía de las crías de rata neonatal, la microinyección de la construcción, y

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Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

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Abstract

La creación de animales transgénicos es un método estándar en el estudio de las funciones de un gen de interés en vivo. Sin embargo, muchos nocaut o animales transgénicos no son viables en los casos en que se expresa el gen modificado o suprimido en todo el organismo. Por otra parte, una variedad de mecanismos de compensación a menudo hacen difícil interpretar los resultados. Los efectos de compensación puede ser aliviado por tanto tiempo la expresión del gen o limitar la cantidad de células transfectadas.

El método de post-natal no ventricular microinyección y electroporación in vivo permite la ejecución selectiva de los genes, o siRNA moléculas de colorante directamente a una pequeña región de interés en el cerebro de roedores recién nacidos. En contraste con la técnica convencional de inyección ventricular, este método permite la transfección de los tipos de células no migratorias. Animales transfectadas mediante el método descrito aquí puede ser usado, por ejemplo, de dos fotones de imágenes in vivo o en experimentos electrofisiológicos en rebanadas de cerebro agudo.

Protocol

1. Introducción

La creación de animales transgénicos es un poderoso método de investigación de las funciones de genes en animales vivos y un mecanismo para desentrañar la enfermedad de 2,3, así como para la manipulación de las propiedades de las células 4. Sin embargo, el procedimiento es bastante laboriosa, extremadamente largo y costoso, por lo que justifica el uso de métodos alternativos de entrega de genes virales como la inyección de 5, la inyección ventricular neonatal con la electroporación 6 y en el útero de la electroporación 7,8. El método de post-natal no ventricular inyección y electroporación tiene un conjunto único de ventajas: uso de no-viral construcciones genéticas; posibilidad de crear un patrón de expresión locales en el área de interés, en la transfección in situ de los tipos de células no migratorias, por ejemplo cortical astrocitos.

En este vídeo, se demuestra el procedimiento detallado de la entrega de genes en el cerebro postnatal de ratas recién nacidos con un plásmido que codifica para el aumento de proteína verde fluorescente bajo el promotor de actina de pollo beta con el CMV potenciador (pCAG-EGFP) 9. Nos ilustran la preparación de la solución inyectable que contienen el plásmido, la fabricación de pipetas de vidrio delgado y montaje de la microinyector en un instrumento estereotáxico. Luego hablamos de anestesiar las crías de rata con isoflurano, sobre la realización de la cirugía, sobre el procedimiento de inyección y de la electroporación utilizando pinzas y electrodos en vivo del evaporador. Finalmente, se analiza brevemente los resultados esperados perspectivas, y las dificultades que puedan surgir durante estos experimentos.

2. Preparación del plásmido para la electroporación

  1. Por lo general, preparar 10 l de la solución de inyección de plásmido en un tubo de 200 l de pared delgada. Esta solución es suficiente para varios experimentos.
  2. Mezclamos 8 l de la solución del plásmido (ver materiales y equipos), con un l de la 10X PBS (ver materiales y equipos) y 1 l de rápida solución al 0,1% de agua verde (ver Materiales y equipo).
  3. La concentración final del plásmido en la solución inyectable debe ser entre 1 y 3 mg / l. Las menores concentraciones de ADN de plásmido se reducirá la eficiencia de transfección, mientras que la concentración de ADN mayor será demasiado viscoso para inyección a través de la punta fina de capilares de vidrio.

3. Preparación de la aguja de vidrio

  1. Para la preparación pipeta de vidrio, se utiliza vidrio de borosilicato con un filamento capilar (ver Materiales y equipo) y un extractor de electrodo de vidrio vertical (ver Materiales y equipo) en tracción máxima y calefacción parámetros.
  2. A continuación, romper la punta de la pipeta con un pedazo de papel para lograr una punta de 10 a 20 micras de diámetro.
  3. Comprobamos el diámetro de la punta y forma bajo el objetivo del microscopio.

4. Microinyector Montaje

  1. El uso de un polímero fino capilar (ver Materiales y equipo) que llene aproximadamente 1 / 3 del volumen de una jeringa de 10 l Hamilton (ver Materiales y equipo) con aceite mineral (ver Materiales y equipo). Evite las burbujas de aire!
  2. Luego llene la pipeta de cristal con aceite mineral e insertar la pipeta en la jeringa Hamilton. Evite las burbujas de aire!
  3. La jeringa con pipeta se fija en el microinyector conectado a un controlador (ver Materiales y equipo).
  4. La configuración de microinyección fija en un instrumento estereotáxico (ver Materiales y equipo) que nos permite sumergirse de forma segura la punta de la pipeta de vidrio en el tubo con la solución de inyección de plásmido.
  5. Cuando la punta toca la superficie de la solución, sumergirla mm más de 1 o 2 y llenar la pipeta con aproximadamente 1 l de la mezcla de la inyección con inyector de la micro controlador.

5. Anestesiar animales

Todos los procedimientos que aquí se presenta se realizó de acuerdo a los reglamentos de la Universidad de Helsinki para los experimentos con animales.

  1. Para cada experimento, se llena una jeringa hermética (ver materiales y equipos), con aproximadamente 2 ml de isoflurano (ver Materiales y equipo).
  2. Que la jeringa se fija en la unidad de anestesia (ver materiales y equipos) conectada a la fuente de flujo de aire, la caja de los animales y la máscara de configuración fija en estereotáctica.
  3. En la unidad de anestesia, que se ajusta el flujo de aire a aproximadamente 250 ml / min y el nivel de isoflurano al 4%.
  4. Ponemos la crías de rata en la caja de los animales durante 2-5 minutos.
  5. Cuando el cachorro deja de moverse, lugar sobre el cojín eléctrico (ver materiales y equipos) unido a la configuración estereotáctica.
  6. Colocar una parte rostral de la cabeza del cachorro en la máscara anestésica.
  7. Se tarda de 5 a 10 minutos para lacachorro para entrar en la anestesia profunda.
  8. Compruebe profundidad de anestesia con un poco de cola y disminuir la afluencia de isoflurano a alrededor de 1,5 a 2,0%.

6. La cirugía, la microinyección y electroporación

  1. El tratamiento de la piel de la cría de cabeza con el 70% de etanol.
  2. Utilizando unas tijeras pequeñas (ver materiales y equipos) y las pinzas finas (ver materiales y equipos), cortar la piel de una piel del cachorro a su frente.
  3. Doblar piezas de piel hacia los lados y tire de las barras del oído poco en los orificios auditivos del cráneo de la cabeza y la fijación de la piel.
  4. El uso de un microscopio binocular, ubicamos el punto bregma en el cráneo.
  5. Identificar la región de interés, utilizando las coordenadas estereotácticas.
  6. La posición de la pipeta de inyección, por encima de esta región y se marca por caer 25-50 nl de la solución inyectable sobre la superficie del cráneo.
  7. Perforar el cráneo con cuidado y suavidad en el punto marcado con un taladro de alta velocidad quirúrgica (ver Materiales y equipo) bajo el microscopio hasta que el líquido aparece en el área perforada.
  8. Fijar una pinza electropotation electrodos (ver materiales y equipos) en los laterales del cráneo con gel conductor de corriente (ver Materiales y equipos) para lograr una mejor conductividad.
  9. Eliminar la caída de líquido de la perforación con tampón pequeños (ver materiales y equipos) y sumergir la aguja de vidrio en el agujero de acuerdo a las coordenadas del sitio de la inyección.
  10. Infundir 25 a 100 nl de la solución inyectable a razón de 5 a 20 nl / seg.
  11. Quite rápidamente la pipeta y electroporar inmediatamente. La electroporación se realiza mediante la aplicación de cinco pulsos rectángulo con la duración de 50 ms y una amplitud de 99 V en la frecuencia de 1 Hz.
  12. Retire los electrodos y barras de oído.
  13. Coser la piel cortada usando una combinación de una pinza de tonto (ver materiales y equipos) y afilado e hilos quirúrgicos (ver Materiales y equipo).
  14. Coloque el perrito en la cámara de calentamiento durante 15-30 minutos para ayudar a su recuperación después de la anestesia.
  15. A continuación, poner la parte de atrás de la jaula de las crías de su madre.

7. Resultados representante

La expresión del transgén en las células transfectadas con éxito aparecerá aproximadamente 10 horas después de la electroporación, y que se mantendrá estable durante varias semanas.

Nos microinyección del plásmido o en capas profundas de la corteza o la región del estriado después del día 2 (P2) crías de ratas Wistar y se realizó en la electroporación in vivo como se describió anteriormente. Rebanadas de cerebro (400 micras de espesor) fueron cortadas después de 2 a 6 días (P4-P8) con un vibrotome en medio frío corte (Hepes buffer solución salina balanceada de Earle) 10. La adquisición de imágenes se realizó con Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal microscopio confocal (Zeiss, Alemania) en el medio de corte a temperatura ambiente.

Los puntos de inyección en profundidad las capas corticales y el cuerpo estriado contiene muchas células transfectadas que expresan EGFP que se encuentra en una región compacta de aproximadamente 200 a 300 micras de diámetro (fig. 1A, B). Dentro de las células transfectadas, el nivel de expresión EGFP es lo suficientemente alta para permitir imágenes de fina procesos celulares (fig. 1C), incluyendo las dendritas de espinas de diferentes formas (Figura 1D) y los paquetes axón (Figura 1). La estabilidad robusta de EGFP, así como la viabilidad celular después de la electroporación permite el rastreo partes distales de los axones (hasta 1,5-2 mm de cuerpos celulares) tales como terminales de cortical (Figura 1 F).

Figura 1
Figura 1. (A) con éxito las células transfectadas en la región del estriado del cerebro de ratas P4 delinear el sitio de la inyección del plásmido. (B) Las células transfectadas en profundas capas corticales (aproximadamente 1000 m debajo de la superficie cortical) de cerebro de rata P5. (C) una célula transfectada en la región del estriado del cerebro de rata P8. (D) los procesos dendríticos de las células transfectadas en la región del estriado del cerebro de rata P8, las flechas indican los diferentes tipos de espinas dendríticas y filopodios. (E) Los axones de las células transfectadas en vía colateral. (F) Los axones terminan en la superficie pial de la corteza de rata P8 (cabeza de flecha). Las barras de escala son 100 m en A, B, E y F, 10 m en C y D.

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Discussion

Métodos de administración de genes en el cerebro de los roedores que viven están bien establecidos en el útero de la electroporación 7,8,11,12 y, más recientemente, para la electroporación postnatal 6. Sin embargo, estos métodos se basan en la inyección intraventricular de ADN plásmido, que puede ser limitante para varias aplicaciones. Por ejemplo, estos métodos no permiten atacar a las células en ciertas áreas cerebrales como el hipocampo, ni la transfección de estos tipos de células no migratorias como los astrocitos corticales. No-ventricular de inyección, junto con la electroporación fue utilizado por primera vez para la entrega de genes en las neuronas del cerebelo 13. Nuestro protocolo ilustra la extensión del método de no-ventricular para otras regiones del cerebro de rata. Proponemos que nuestro enfoque metodológico es una alternativa útil a los métodos de entrega de genes virales en las zonas restringidas de interés dentro de cerebro de rata postnatal 5.

A pesar de las ventajas del método actual, algunas dificultades se puede esperar como veremos a continuación.

1.Optimal edad de los animales

Cuando sea posible, más jóvenes crías de rata neonatal se debe utilizar, como medio para incrementar tanto la eficacia de la transfección y supervivencia de las crías después de la cirugía. En nuestras manos, la P0 cachorros son muy pequeños, ya que es difícil apuntar y reproducen una determinada zona del cerebro utilizando estereotáxica coordenadas obtenidas de los atlas del cerebro disponible para esta edad de 14 años. Además, el P0 cachorros tienen la piel fina y sensible que pueda impedir la costura. El P3 y P4 son los más convenientes en términos de manipulaciones quirúrgicas y estereotáxica en comparación con P0-P2 animales, pero tienen hipersensibilidad a la anestesia con isoflurano que puede causar convulsiones y las interrupciones de la respiración durante la cirugía. Por lo tanto, la mejor opción es P1-P2 crías de ratas que son predecibles durante la cirugía y lo suficientemente grande como para microinyecciones reproducible.

Problemas 2.Possible con microinyección

Cuando los pequeños volúmenes de solución (25-100 nl) se inyecta a través de la punta de vidrio delgado para el tejido cerebral ejerce una presión opuesta, es fundamental que las burbujas de aire o fugas son cuidadosamente evitados. Si no se evitan estos factores pueden causar una dramática disminución en la eficiencia de transfección.

3.Precision límites de las coordenadas estereotácticas

A pesar de la precisión de las coordenadas estereotácticas, que tienen un límite en la reproducibilidad de 0,3 mm 15. En nuestra experiencia el uso de animales de la misma edad y peso, es posible reducir este límite a 0,2-0,1 mm, que es suficiente para orientar reproducible del área CA1 del hipocampo.

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Acknowledgements

Damos las gracias a Ekaterina Karelina para ayudar con la grabación de la banda sonora para el vídeo, Ivan Molotkov de animación en 3D y el Dr. Peter Blaesse de CAG-EGFP preparación de plásmidos.

El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Fundación Cultural de Finlandia y la Academia de Finlandia.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

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