בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Biology
 

Summary

פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד של בתאי גזע מבלוטת הרוק עכבר מתואר. שיטה מעסיקה עיכול אנזימטי מכני, והיתרי הבידוד של salispheres המכילה תאים בעלי מאפיינים של בתאי גזע.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

בלוטות הרוק הן מבוגרות ממוצא אנושי עכבר מהווים מינימום של חמישה סוגי תאים, שכל אחד מהם מאפשר ייצור והפרשה של הרוק לחלל הפה. תאים acinar הצפק ו רירי הם חלבונים מפעלים לייצור הרירי של בלוטת בהתאמה, המייצגים את מקורו של ייצור הרוק. מסונתז פעם, המרכיבים השונים proteinaceous האנזימטית אחרים של רוק מופרשים דרך סדרה של תאים אפיתל ductal נושאות מסוג מורפולוגיה, עד הגירוש הסופי של הרוק דרך צינור אחד גדול לתוך חלל הפה. הרכב הרוק הוא שונה גם על ידי תאים ductal במהלך תהליך זה.

בשנת ביטוי של מחלות כגון תסמונת סיוגרן, ובכמה מצבים קליניים כגון טיפול הקרנות לסרטן הראש והצוואר, ייצור רוק על ידי בלוטות מצטמצם באופן דרמטי 1,2. Xerostomia וכתוצאה מכך, תחושה סובייקטיבית של יובש בפה, משפיע לא רק על היכולת של החולה לבלוע ולדבר, אלא גם מעודדת את התפתחות עששת שיניים יכול להיות מתיש חברתית הסובל.

שיקום ייצור הרוק הנ"ל תנאים קליניים ולכן מהווה צורך קליני מסופקים, וכן מספר מחקרים כאלה הוכיחו את יכולת ההתחדשות של בלוטות הרוק 3-5. בהמשך בידודה של דמוי תא גזע אוכלוסיות של תאים מרקמות שונות בתוך העכבר גופות אדם 6-8, הראינו באמצעות השיטה המתוארת כי תאי גזע שבודדו בלוטות הרוק העכבר יכול לשמש כדי להציל את ייצור הרוק הרוק מוקרן בלוטות 9,10. תגלית זו סוללת את הדרך לפיתוח טיפולים מבוססי תאים גזע לטיפול התנאים xerostomic בבני אדם, וגם חקר של בלוטת הרוק כמו microenvironment המכילה תאים בעלי יכולת חידוש עצמי multipotent.

Protocol

1. ריג'נט הכנה

  1. הצפת: 1% (w / v) בסרום שור אלבומין תמיסת מלח מאוזנת של האנק
  2. אנזימים מחדש. אנזים Hyaluronidase: 40 מג / מ"ל, מומס חיץ. Collagenase II: 23mg / mL, מומס חיץ. השתמש טרי פתרונות אנזים מוכן טרי בידוד כל אחד. כאשר מומס, לאחסן ב 4 ° C עד השימוש לעיכול.
  3. 50 mM סידן כלוריד במים מזוקקים. סנן לעקר דרך פילטר בגודל 0.2 UM הנקבוביות.
  4. עכבר בלוטת הרוק (MSG) בינוני תרבות: DMEM: F12 עם פניצילין (100 IU / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), glutamax (2 מ"מ), גידול אפידרמיס גורם-2 (20 ng / mL), גורם הגדילה פיברובלסטים אינסולין -2 (20 ng / mL), N2 תוספת (1%), (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו dexamethasone (1 מיקרומטר).

2. רקמות מכונות עיכול אנזימתי

  1. לשקול את בלוטות הרוק גזור.
  2. קוצצים בלוטות לתערובת הומוגנית באמצעות מספריים סטרילי לנתיחה מעוקל בצלחת פטרי קטנות.
  3. איסוף רקמות טחון ב 14 צינורות מ"ל, באמצעות 1mL של חיץ לכל רקמה submandibular 80mg. שוטפים את בצלחות פטרי נקי של רקמה בעזרת כמה למאגר.
  4. הוסף 1 מ"ל של חיץ לכל רקמה 80 מ"ג, ואחריו פתרון אנזים 25 μL II collagenase, 25 פתרון μL אנזים hyaluronidase ו 250 סידן כלוריד μL פתרון לכל רקמה 80 מ"ג. אם עובדים עם כמויות גדולות של רקמה, צעדים 2.4-2.9 ניתן לבצע T25 תרבות צלוחיות רקמות לנוחות.
  5. מדגירים את waterbath רועד להגדיר 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לתערובת אנזים ביסודיות דרך רקמות שוב.
  6. החלף ב waterbath לעוד 20 דקות.
  7. איסוף רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 400, למשך 8 דקות. בטל supernatant.
  8. Resuspend במאגר 2 מ"ל של כל רקמות 80 מ"ג, ולחזור האנזים סידן כלוריד בנוסף לעיל. דגירה 20 דקות באמבט מים רועד. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לערבב אנזימים ביסודיות.
  9. דגירה של 20 דקות האחרון רועד אמבט מים. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה לעיל, להשליך supernatant.

3. כביסה שלבים

  1. Resuspend כל 80 מ"ג של רקמות החיץ 2 מ"ל ו פיפטה לשטוף רקמה חופשית של אנזימים.
  2. צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant.
  3. חזור על לשטוף באמצעות חיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג. צנטריפוגה לאסוף, להשליך supernatant.

4. סינון

  1. Resuspend פתרון רקמות החיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג.
  2. הוספת הפתרון לסינון 100 מיקרומטר נקבוביות בגודל ממוקמים מעל הצינור פלקון 50 מ"ל. אין ליישם יותר מ -3 MLS של פתרון רקמות טחון לכל עמודה, כמו מסנני עלול להיחסם. אפשר לחלחל. הסרת חומר מסונן תלוי התחתון של סינון לפי פיפטה, ומוסיפים תסנין.
  3. השתמש במזרק עם מחט 26 מד לקחת תסנין מ 50 מ"ל צינורות חלים 50 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות על 5 צינורות מ"ל. אפשר לסנן דרך, סיוע על ידי שחרור מכסים במידת הצורך.
  4. צינורות צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant.

5. ציפוי ובינוניים

  1. מערבבים את כל הגרגרים לתוך בכרך אחד. ספירה באמצעות מונה תא haemocytometer אוטומטיות או.
  2. תאים פלייט בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל גם צלחת 12 היטב, או 2.67 x 10 6 תאים לכל בקבוק T25 בתרבית רקמה. הוסף 1 מ"ל MSG בינוני עד טוב כל או 6 מ"ל ל T25 כל בקבוק.
  3. לדגור על 37 ° C. Spheres צריך להיות לעין ביום 2.

6. נציג תוצאות:

אחרי יומיים שלושה בתרבות, אגרגטים של תאים קטנים (salispheres) יהיה ניכר התרבויות. Salispheres ימשיך לגדול בגודל על פני תקופה של עשרה ימים בתרבות. נציג בניגוד לשלב תמונות של מיקרוסקופיה salispheres מוצגים באיור 1. התאים מתרבים להביע תא גזע חלבונים הקשורים הסמן יכול להיות מבודד בתחומים אלה, בצורה אופטימלית בין בידוד 3-5 שלאחר ימים, ומסוגלים הבחנה לתוך תפקודית, רוק לייצר תאים acinar.

איור 1
באיור 1. היווצרות Salisphere במבחנה. בעקבות עיכול מכני אנזימטיות באמצעות פרוטוקול הנוכחי, תחומי הגדלת גודל ניתן למצוא בתרבויות צף. לוחות מייצגים בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות של תחומים מהימים 0 (א), 4 (ב), 7 (ג) ו 10 (ד). בר סולם = 50 מיקרומטר.

Discussion

השיטה המתוארת כאן בתרבית רקמה מייצג פרוטוקול לשחזור עבור בידוד של התא המכיל גזע salispheres מ בלוטות הרוק של עכברים. מחקרים באמצעות תאים מבודדים בצורה זו הדגישו את יכולת ההתחדשות של בלוטת הרוק בתאי גזע 9. השתלה של 100 של c-Kit + בתאים שמקורם salispheres המושרה התאוששות תפקודית של בלוטות הרוק עכבר מוקרן. נתונים אלה מרגש לספק נקודת התחלה עבור החקירה של טיפול בתאי גזע מבוסס על xerostomia. אפיקים רבים להישאר כדי להיחקר עם זאת, כולל את פרופיל ביטוי מלא חלבון סמן של בתאי גזע, היכולת של בלוטות submandibular להציל את תפקוד בלוטות הרוק הפרוטיד מוקרן ולהיפך, ואת האפיון של המשוערת בנישה של תא גזע vivo התאים. בסופו של דבר, את התרגום של פרוטוקול זה דגימות רקמה אנושית ואת הפוטנציאל הבאים לטיפול של xerostomia בחולים אנושיים באמצעות תאים מבודדים הוא היישום המלהיב ביותר של השיטה המתוארת.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics