Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Biology
 

Summary

Оптимизированный протокол для выделения стволовых клеток из мыши слюнной железы описана. Метод использует ферментативной и механической пищеварение, и позволяет изоляции salispheres содержащие клетки с характеристиками стволовых клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Зрелые слюнных желез как человеческие, так и мышь происхождения составляют менее пяти типов клеток, каждый из которых обеспечивает производство и выделение слюны в полости рта. Серозный и клеток слизистой ацинарных являются белков и слизистых заводы железы, соответственно, и представляют происхождение выработку слюны. Как только синтезируется, различные ферментативные и другие белковые компоненты слюны выделяются через ряд протоков эпителиальных клеток, несущих типа морфологии, до возможной высылке слюной через один крупный канал в полость рта. Состав слюны также влияет протоков клеток во время этого процесса.

В проявлением таких заболеваний, как синдром Шегрена, а в некоторых клинических ситуациях, таких как лучевая терапия для лечения рака головы и шеи, слюны производства желез резко сокращается 1,2. В результате сухость во рту, субъективное ощущение сухости во рту, влияет не только на способности пациента глотать и говорить, но и способствует развитию кариеса зубов и может быть социально изнурительных для больного.

Восстановление выработку слюны в вышеупомянутых клинических состояний, следовательно, представляет неудовлетворенных клинической необходимости, и в этом качестве несколько исследований показали, регенеративная способность слюнных желез 3-5. В дополнение к изоляции стволовых клеток, как популяций клеток из различных тканей в мыши и человеческих тел, 6-8, мы показали, описанным способом, что стволовые клетки, выделенные из мыши слюнных желез могут быть использованы, чтобы спасти производство слюны при облучении слюнных желез 9,10. Это открытие открывает путь к развитию на основе стволовых клеток терапий для лечения xerostomic условиях в организме человека, а также для исследования слюнных желез, как микросреда, содержащих клетки с мультипотентные самообновлению возможностей.

Protocol

1. Регент подготовка

  1. Буфер: 1% (м / о) бычьего сывороточного альбумина в сбалансированном солевом растворе Хэнка
  2. Развести ферментов. Гиалуронидаза фермента: 40 мг / мл, растворяют в буфере. Коллагеназы II: 23mg / мл, растворяют в буфере. Используйте свежеприготовленные фермента решения свежей для каждого изоляции. При растворении, хранить при 4 ° С до использования для пищеварения.
  3. 50 мМ хлорида кальция в дистиллированной воде. Фильтры стерилизовать через 0,2 мкм поры фильтра размера.
  4. Мышь слюнной железы (MSG) культуральная среда: DMEM: F12 с пенициллином (100 МЕ / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), glutamax (2 мМ), эпидермальный фактор роста-2 (20 нг / мл), фактор роста фибробластов -2 (20 нг / мл), N2 дополнение (1%), инсулин (10 мкг / мл) и дексаметазоном (1 мкМ).

2. Механические и ферментативной тканей Пищеварение

  1. Взвесьте расчлененный слюнных желез.
  2. Чоп желез в однородную целлюлозы с использованием стерильных изогнутые ножницы рассечение в маленькой чашке Петри.
  3. Сбор измельченной ткани в 14 мл трубы, с помощью 1 мл буфера в 80 мг подчелюстной ткани. Полоскание чашки Петри чистой ткани, используя некоторые из буфера.
  4. Добавьте еще 1 мл буфера на 80 мг ткани, а затем 25 мкл коллагеназа II раствора фермента, 25 мкл раствора фермента гиалуронидазы и 250 мкл раствора хлорида кальция на 80 мг ткани. При работе с большим количеством ткани, шаги 2,4 - 2,9 может быть выполнена в культуре ткани T25 Колбы для удобства.
  5. Инкубируйте в пожимая водяной бане установлена ​​на уровне 37 ° С в течение 20 минут. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно через ткани снова.
  6. Заменить в водяной бане в течение еще 20 минут.
  7. Сбор ткани с помощью центрифугирования при 400 мкг, в течение 8 минут. Удалите супернатант.
  8. Ресуспендируют в 2 мл буфера для каждого 80 мг ткани, и повторить фермента и помимо хлорида кальция, что и выше. Инкубируйте 20 минут тряски в водяной бане. Удалить труб и растирают пипеткой для смешивания ферментов тщательно.
  9. Инкубировать последние 20 минут тряски в водяной бане. Сбор клетки центрифугированием, как выше, отбросить супернатант.

3. Стиральная шаги

  1. Ресуспендируют каждые 80 мг ткани в 2 мл буфера и пипетки для мытья ткани свободных ферментов.
  2. Центрифуга, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.
  3. Повторите мыть с использованием 1 мл буфера на 80 мг ткани. Центрифуга для сбора, отбросить супернатант.

4. Фильтрация

  1. Ресуспендируют ткани раствор в 1 мл буфера на 80 мг ткани.
  2. Добавить решение до 100 мкм пор по размерам фильтре, расположенном более чем в 50 мл трубки Falcon. Не применять более 3 мл рубленого решение ткани на колонке, а фильтры могут быть заблокированы. Разрешить просачиваться. Удалить фильтруется материал висит на нижней фильтра пипеткой, и добавить к фильтрату.
  3. Используйте шприц с иглой 26 взять 50 мл фильтрата из труб и применяются до 50 мкм поры фильтров размером по 5 мл пробирок. Позвольте фильтр, помощь, ослабив крышками, если необходимо.
  4. Пробирки центрифужные, как ранее, чтобы собраться. Удалите супернатант.

5. Покрытие и среднего

  1. Смешайте все гранулы в одном томе. Граф с помощью автоматизированных счетчик ячейки или гемоцитометра.
  2. Пластина клетки при плотности 0,4 х 10 6 клеток на лунку 12-луночного планшета, или 2,67 х 10 6 клеток на T25 колбу культуры ткани. Добавьте 1 мл MSG среду в каждую лунку или 6 мл на каждый T25 колбу.
  3. Инкубировать при 37 ° C. Сферы, должны быть четко видимые днем ​​2.

6. Представитель Результаты:

Через два-три дня в области культуры, малые агрегаты клеток (salispheres) будет очевидным в культурах. Salispheres будет продолжать увеличиваться в размерах в течение десяти дней в культуре. Представитель микроскопии фазового контраста изображения salispheres показаны на рисунке 1. Пролиферирующих клеток, экспрессирующих стволовых клеток, белков, связанных с маркером может быть изолирована от этих сфер, оптимально 3-5 дней между сообщению изоляции, и способны к дифференцировке в функциональные, слюна ацинарных клеток.

Рисунок 1
Рисунок 1. Salisphere образование в пробирке. После механического и ферментативного пищеварения использовании настоящего протокола, сферы увеличением размера можно найти в плавучий культурами. Панели представитель фазового контраста изображения микроскопии сфер от нескольких дней 0 (), 4 (B), 7 (C) и 10 (D). Шкала бар = 50 мкм.

Discussion

Метод культуры тканей, описанные здесь представляет воспроизводимый протокол для выделения стволовых клеток, содержащих salispheres из слюнных желез мышей. Исследования с использованием клеток, выделенных таким образом выявили регенеративная способность слюнной железы стволовыми клетками 9. Трансплантация сто с-Kit + клетки, полученные из индуцированных salispheres функционального восстановления облученных мышей слюнных желез. Эти данные являются захватывающими и обеспечить отправную точку для исследования стволовых клеток для терапии, основанной на сухость во рту. Многие пути еще предстоит исследовать однако, в том числе полного маркера экспрессии белка профиля стволовых клеток, способность подчелюстной желез, чтобы спасти функции облученных околоушной слюнной железы, и наоборот, и характеристика предполагаемых в естественных условиях стволовые клетки ниши клеток. В конечном счете, перевод этот протокол для образцов человеческой ткани и последующем потенциал для лечения ксеростомии в человеческом пациентов с использованием изолированных клеток является самым захватывающим применения описанного метода.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics