Aislamiento de células de la glándula salival del ratón madre

Biology
 

Summary

Un protocolo optimizado para el aislamiento de células madre de la glándula salival del ratón se describe. El método emplea la digestión enzimática y mecánica, y permite el aislamiento de salispheres que contiene células con características de células madre.

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Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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Abstract

Madura glándulas salivales tanto de origen humano y el ratón integrado por un mínimo de cinco tipos de células, cada una de las que facilita la producción y excreción de saliva en la cavidad oral. Las células acinares serosas y mucosas son las proteínas y las mucosas de las fábricas que producen las glándulas, respectivamente, y representan el origen de la producción de saliva. Una vez sintetizados, los diversos componentes proteicos enzimáticos y otros de la saliva se secreta a través de una serie de células ductales epiteliales teniendo morfología de tipo, hasta la expulsión definitiva de la saliva a través de un conducto principal en la cavidad de la boca. La composición de la saliva también es modificado por las células ductales durante este proceso.

En la manifestación de enfermedades como el síndrome de Sjögren, y en algunas situaciones clínicas como el tratamiento de radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello, la producción de saliva por las glándulas se reduce drásticamente 1,2. La xerostomía como resultado, una sensación subjetiva de boca seca, no sólo afecta a la capacidad del paciente para tragar y hablar, sino que también fomenta el desarrollo de la caries dental y puede ser socialmente debilitante para la víctima.

La restauración de la producción de saliva en las condiciones clínicas antes mencionadas por lo tanto, representa una necesidad clínica no cubierta, y como tal, varios estudios han demostrado la capacidad de regeneración de las glándulas salivales 3-5. En relación con el aislamiento de células madre similares a las células de poblaciones de células de diversos tejidos en el ratón y el cuerpo humano 6.8, hemos demostrado mediante el método descrito que las células madre aisladas de las glándulas salivales del ratón se puede utilizar para rescatar a la producción de saliva en la saliva irradiados glándulas 9,10. Este descubrimiento abre el camino para el desarrollo de células madre basado en terapias para el tratamiento de las condiciones de xerostomía en los seres humanos, y también para la exploración de las glándulas salivales como un microambiente que contiene células pluripotentes, con capacidad de auto-renovación.

Protocol

1. Regent Preparación

  1. Buffer: 1% (w / v) de albúmina sérica bovina en solución salina equilibrada de Hank
  2. Reconstituir las enzimas. Enzima hialuronidasa: 40 mg / ml, se disolvieron en el tampón. Colagenasa II: 23 mg / ml, se disolvieron en el tampón. Utilice soluciones recién preparadas enzima fresca para cada aislamiento. Cuando se disuelve, se almacenan a 4 ° C hasta su uso para la digestión.
  3. 50 mM de cloruro de calcio en agua destilada. Filtro de esterilización a través de un filtro de 0,2 uM tamaño de los poros.
  4. Ratón glándulas salivales (MSG) del medio de cultivo: DMEM: F12 con penicilina (100 UI / ml), estreptomicina (100 mg / mL), glutamax (2 mM), factor de crecimiento epidérmico-2 (20 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos la insulina-2 (20 ng / ml), N2 suplemento (1%), (10 mg / mL) y dexametasona (1 M).

2. Tejidos mecánica y digestión enzimática

  1. Pesar de las glándulas salivales disecados.
  2. Picar las glándulas en una pasta homogénea con tijeras de disección estéril curva en una pequeña placa de Petri.
  3. Recoger tejido picado en 14 ml tubos, con 1 ml de tampón por tejido submandibular 80 mg. Enjuagar los platos petri limpia de tejido utilizando algunos de los buffer.
  4. Añadir otra 1 mL de tampón por tejido de 80 mg, seguido de 25 solución de la enzima colagenasa l II, 25 l solución de enzima hialuronidasa y 250 l solución de cloruro de calcio por los tejidos de 80 mg. Si se trabaja con grandes cantidades de tejido, los pasos 2,4 a 2,9 se puede realizar en T25 frascos de cultivo de tejidos para mayor comodidad.
  5. Incubar en un baño de agua agitando a 37 ° C durante 20 minutos. Retire los tubos y triturar con una pipeta de mezcla de enzimas a fondo a través del tejido nuevo.
  6. Vuelva a colocar en el baño de agua durante 20 minutos.
  7. Recoge los tejidos por centrifugación a 400 xg, durante 8 minutos. Desechar el sobrenadante.
  8. Resuspender en tampón de 2 ml por cada 80 mg de tejido, y repetir la enzima y la adición de cloruro de calcio que el anterior. Incubar 20 minutos en baño de agua agitando. Retire los tubos y triturar con una pipeta de mezcla de enzimas a fondo.
  9. Incubar durante 20 minutos finales en el baño de agua agitando. Recoger las células por centrifugación como anteriormente, desechar el sobrenadante.

3. Pasos para el lavado

  1. Resuspender cada 80 mg de tejido en el tampón de 2 ml y una pipeta para lavar los tejidos libres de las enzimas.
  2. Centrifugar como se ha de recoger. Desechar el sobrenadante.
  3. Repetir el lavado con 1 ml de tampón por mg de tejido 80. Centrífuga para recoger, desechar el sobrenadante.

4. Filtración

  1. Resuspender solución de tejido en el tampón de 1 ml por mg de tejido 80.
  2. Añadir la solución a 100 micras de tamaño de poro de filtro colocado más de 50 ml tubo Falcon. No aplicar más de 3 ml de solución de tejido picado por columna, como los filtros pueden obstruirse. Permiten que se filtre a través de. Retire el material de filtrado colgando en la parte inferior del filtro con una pipeta, y añadir a filtrado.
  3. Use una jeringa con aguja de calibre 26 para tomar filtrado de 50 ml tubos y filtros se aplican a 50 micras de tamaño de poro en tubos de 5 ml. Deje que se filtra a través de, la asistencia al aflojar las tapas, si es necesario.
  4. Tubos de centrifugación como se ha de recoger. Desechar el sobrenadante.

5. Revestimiento y Mediana Empresa

  1. Combine todos los pellets en un solo volumen. Contar con contador de células automatizado o hemocitómetro.
  2. Células de la placa a una densidad de 0,4 x 10 6 células por pocillo de 12 y placa, o 2.67 x 10 6 células por frasco de cultivo de tejidos T25. Añadir un medio de MSG ml a cada pocillo o 6 ml a cada frasco T25.
  3. Se incuba a 37 ° C. Ámbitos debe ser claramente visible el día 2.

6. Los resultados representativos:

Después de dos o tres días en la cultura, pequeños agregados de células (salispheres) será evidente en los cultivos. Salispheres seguirá creciendo en tamaño durante un período de diez días en la cultura. Representante fase imágenes de microscopía de contraste de salispheres se muestra en la Figura 1. Proliferación de las células que expresan las células madre de proteínas asociadas a marcadores se pueden aislar de estos ámbitos, de manera óptima entre el aislamiento días después del 3-5, y son capaces de diferenciarse en células funcionales, producen la saliva acinar.

Figura 1
Figura 1. Salisphere formación in vitro. Después de la digestión mecánica y enzimática con el presente Protocolo, las esferas de tamaño cada vez mayor se puede encontrar en las culturas flotante. Los paneles son representativos fase de imágenes de microscopía de contraste de las esferas de los días 0 (A), 4 (B), 7 (C) y 10 (D). Barra de escala = 50 micras.

Discussion

El método de cultivo de tejidos descrito aquí representa un protocolo reproducible para el aislamiento de células madre que contienen salispheres de las glándulas salivales de los ratones. Los estudios que utilizan células aisladas de este modo se ha destacado la capacidad de regeneración de células de la glándula salival madre 9. El trasplante de un centenar de c-Kit + células derivadas de la salispheres inducida recuperación funcional de las glándulas salivales de ratón irradiados. Estos datos son muy interesantes y un punto de partida para la investigación de células madre basado en la terapia para la xerostomía. Muchos caminos quedan por explorar sin embargo, incluyendo el perfil de expresión de los marcadores completa de proteínas de las células madre, la capacidad de las glándulas submandibulares de rescatar la función de las glándulas parótidas irradiados salivales y viceversa, y la caracterización de la supuesta en el nicho de células madre in vivo de las células. En última instancia, la traducción de este protocolo para las muestras de tejido humano y el potencial posterior para el tratamiento de la xerostomía en pacientes humanos con las células aisladas es la aplicación más interesante del método descrito.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
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    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

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