Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Biology
 

Summary

Um protocolo otimizado para o isolamento de células-tronco a partir da glândula salivar do mouse é descrito. O método emprega digestão enzimática e mecânica, e permite o isolamento de salispheres contendo células com características de células-tronco.

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Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

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Abstract

Madura glândulas salivares de origem humana e do rato compreendem um mínimo de cinco tipos de células, cada qual facilita a produção e excreção de saliva na cavidade oral. Células acinares serosas e as mucosas são as proteínas e fábricas que produzem muco da glândula, respectivamente, e representam a origem da produção de saliva. Uma vez sintetizados, os vários enzimática e outros componentes proteicas de saliva são secretados por uma série de células epiteliais ductais rolamentos do tipo morfologia, até que a eventual expulsão da saliva através de um duto grande para a cavidade da boca. A composição da saliva também é modificado pelas células ductais durante este processo.

Na manifestação de doenças como a síndrome de Sjögren, e em algumas situações clínicas, tais como o tratamento de radioterapia para câncer de cabeça e pescoço, a produção de saliva pelas glândulas é drasticamente reduzido 1,2. A xerostomia resultante, uma sensação subjetiva de boca seca, afeta não só a capacidade do paciente de engolir e falar, mas também incentiva o desenvolvimento de cárie dentária e pode ser socialmente debilitante para o sofredor.

A restauração da produção de saliva nas condições acima mencionadas clínica, portanto, representa uma necessidade não atendida clínica, e, como tal, vários estudos têm demonstrado a capacidade de regeneração das glândulas salivares 3-5. Mais para o isolamento de células-tronco como as populações de células de vários tecidos dentro do mouse e corpos humanos 6-8, temos mostrado usando o método descrito que as células-tronco isoladas das glândulas salivares do mouse pode ser usado para resgatar a produção de saliva na salivares irradiadas glândulas 9,10. Esta descoberta abre o caminho para o desenvolvimento de células-tronco terapias baseadas no tratamento de condições xerostomic em seres humanos, e também para a exploração da glândula salivar como um microambiente contendo células multipotentes com capacidades de auto-renovação.

Protocol

1. Preparação Regent

  1. Buffer: 1% (w / v) de soro albumina bovina em solução salina balanceada de Hank
  2. Enzimas reconstituir. Enzima hialuronidase: 40mg / mL, dissolvido em tampão. Colagenase II: 23mg / mL, dissolvido em tampão. Utilizar soluções recentemente enzima preparado fresco para cada isolamento. Quando dissolvido loja, a 4 ° C até o uso para a digestão.
  3. 50 mM de cloreto de cálcio em água destilada. Filtro de esterilização através de um filtro tamanho 0,2 uM poros.
  4. Glândulas salivares do rato meio de cultura (MSG): DMEM: F12 com penicilina (100 UI / mL), estreptomicina (100 mg / mL), Glutamax (2 mM), fator de crescimento epidérmico-2 (20 ng / mL), fator de crescimento de fibroblastos -2 (20 ng / mL), N2 suplemento (1%), a insulina (10 mcg / mL) e dexametasona (1 mM).

2. A digestão enzimática do tecido mecânico e

  1. Pesar as glândulas salivares dissecadas.
  2. Pique glândulas em uma polpa homogênea usando uma tesoura esterilizada dissecção curvas em uma pequena placa de Petri.
  3. Coletar tecido picada em 14 mL tubos, usando 1mL de tampão por tecido submandibular 80mg. Lave os pratos de Petri limpa de tecido usando algumas das buffer.
  4. Adicionar outro 1 mL de tampão por 80 mg de tecido, seguido de 25 mL de solução de enzima colagenase II, 25 mL de solução de enzima hialuronidase e 250 mL de solução de cloreto de cálcio por 80 mg de tecido. Se trabalhar com grandes quantidades de tecido, as etapas 2,4-2,9 pode ser realizada em frascos de cultura de tecidos T25 por conveniência.
  5. Incubar em banho-maria agitando-se a 37 ° C por 20 minutos. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar completamente enzima através do tecido novo.
  6. Substituir em banho-maria por mais 20 minutos.
  7. Coletar tecido por centrifugação a 400 xg, por 8 minutos. Elimine o sobrenadante.
  8. Ressuspender em 2 mL de tampão para cada tecido de 80 mg, e repita enzima ea adição de cloreto de cálcio como acima. Incubar 20 minutos em banho-maria agitando. Remova os tubos e triturar com uma pipeta para misturar enzimas completamente.
  9. Incubar por 20 minutos finais em tremendo banho de água. Coletar células por centrifugação, tal como acima, elimine o sobrenadante.

3. Etapas de lavagem

  1. Ressuspender cada 80 mg de tecido em 2 mL de tampão e pipetar para lavar tecidos livres de enzimas.
  2. Centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante.
  3. Repita lavagem usando um tampão por 80 mL de tecido mg. Centrífuga para coletar, elimine o sobrenadante.

4. Filtragem

  1. Ressuspender solução tecido em 1 mL de tampão por 80 mg de tecido.
  2. Adicionar solução para filtro de 100 mm de poro de tamanho colocado mais de 50 tubos Falcon mL. Não aplique mais de 3 mL de solução de tecido picada por coluna, como filtros podem ficar bloqueados. Permitir a vazar. Remover o material filtrado pendurado na parte de baixo do filtro, com uma pipeta, e adicionar ao filtrado.
  3. Use seringa com agulha de calibre 26 para tomar a partir de 50 mL filtrado tubos e aplicar filtros para 50 mm tamanho dos poros, em 5 tubos mL. Permitem filtrar, auxiliando soltando tampas, se necessário.
  4. Tubos de centrífuga como antes para coletar. Elimine o sobrenadante.

5. Revestimento e Médio

  1. Combine todos os pellets em um volume. Contagem usando contador de células automatizado ou hemocitómetro.
  2. Células da placa com uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço, de 12 bem-placa, ou 2,67 x 10 6 células por frasco de cultura de tecidos T25. Adicionar um meio MSG mL em cada poço ou 6 ml para cada frasco T25.
  3. Incubar a 37 ° C. Esferas devem ser claramente visível de dia 2.

6. Resultados representativos:

Depois de 2-3 dias em cultura, pequenos agregados de células (salispheres) será evidente nas culturas. Salispheres continuará a crescer em tamanho ao longo de um período de 10 dias em cultura. Representante fase de imagens de microscopia de contraste de salispheres são mostrados na Figura 1. Células em proliferação expressando as proteínas de células-tronco associada marcador pode ser isolado de tais esferas, otimamente entre os dias de isolamento pós 3-5, e são capazes de diferenciação em funcionais, saliva células acinares produzindo.

Figura 1
Figura 1. Salisphere formação in vitro. Após a digestão mecânica e enzimática utilizando o protocolo atual, esferas de tamanho crescente pode ser encontrado nas culturas flutuante. Os painéis são representativos fase de imagens de microscopia de contraste de esferas de dias 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra de escala = 50 mm.

Discussion

O método de cultura de tecidos descrito aqui representa um protocolo reprodutível para o isolamento de células-tronco contêm salispheres das glândulas salivares de ratos. Estudos utilizando células isoladas desta forma têm destacado a capacidade regenerativa das células da glândula salivar-tronco 9. Transplante de uma centena de células + c-Kit derivado do salispheres induzida a recuperação funcional das glândulas salivares de ratos irradiados. Estes dados são estimulantes e fornecer um ponto de partida para a investigação de células-tronco para terapia baseada xerostomia. Muitos caminhos ainda precisam ser exploradas no entanto, incluindo a plena perfil de expressão do marcador de proteína das células-tronco, a capacidade das glândulas submandibulares de resgatar a função das glândulas salivares parótidas irradiadas e vice-versa, ea caracterização da suposta in vivo nicho de células-tronco de as células. Em última análise, a tradução deste protocolo para amostras de tecido humano eo potencial subseqüente para o tratamento da xerostomia em pacientes humanos utilizando células isoladas é a aplicação mais empolgante do método descrito.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

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References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
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    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

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