Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Biology
 

Summary

Ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus der Maus Speicheldrüse beschrieben. Die Methode nutzt enzymatische und mechanische Verdauung, und erlaubt Isolierung salispheres enthaltenden Zellen mit Eigenschaften von Stammzellen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pringle, S., Nanduri, L. S., Marianne, v. d., Ronald, v. O., Coppes, R. P. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. J. Vis. Exp. (48), e2484, doi:10.3791/2484 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ältere Speicheldrüsen von Mensch und Maus Herkunft aus einem Minimum von fünf Zelltypen, von denen jede die Produktion und Ausschüttung von Speichel erleichtert in die Mundhöhle. Serösen und Schleimhäuten Azinuszellen sind die Protein-und Schleim produzieren Fabriken der Drüse bzw. und stellen den Ursprung der Speichelproduktion. Sobald synthetisiert werden die verschiedenen enzymatischen und anderen proteinhaltigen Komponenten des Speichels durch eine Reihe von duktalen Zellen, die epithelial-Art-Morphologie abgesondert wird, bis die eventuellen Ausweisung der Speichel durch einen großen Kanal in der Mundhöhle. Die Zusammensetzung des Speichels wird auch durch den duktalen Zellen während dieses Prozesses verändert.

In der Manifestation von Krankheiten wie Sjögren-Syndrom, und in einigen klinischen Situationen wie Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren, die Speichelproduktion durch die Drüsen ist dramatisch 1,2 reduziert. Die daraus resultierenden Xerostomie, ein subjektives Gefühl der Mundtrockenheit, betrifft nicht nur die Fähigkeit des Patienten zu schlucken und sprechen, sondern fördert auch die Entwicklung von Karies und kann sozial schwächenden für den Erkrankten.

Die Wiederherstellung der Speichel-Produktion in den oben genannten klinischen Bedingungen stellt daher einen ungedeckten klinischen Bedarf, und als solche haben mehrere Studien die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüsen 3-5 gezeigt. Im Anschluss an die Isolierung von Stammzellen, wie Populationen von Zellen aus verschiedenen Geweben innerhalb der Maus und menschlichen Körpern 6-8, haben wir gezeigt, mit dem beschriebenen Verfahren, dass Stammzellen aus der Maus Speicheldrüsen isoliert verwendet werden, um die Speichelproduktion in bestrahlten Speicheldrüsen zu retten Drüsen 9,10. Diese Entdeckung ebnet den Weg für die Entwicklung von Stammzell-basierten Therapien für die Behandlung von Xerostomie Verhältnisse beim Menschen, aber auch für die Erforschung der Speicheldrüse als Mikroumgebung enthaltenden Zellen mit multipotenten selbst erneuernde Fähigkeiten.

Protocol

1. Regent Vorbereitung

  1. Buffer: 1% (w / v) Rinderserumalbumin in balanced salt Hank-Lösung
  2. Rekonstituieren Enzyme. Hyaluronidase-Enzym: 40 mg / mL, in Puffer gelöst. Collagenase II: 23 mg / mL, in Puffer gelöst. Verwenden Sie frisch zubereitete Enzymlösungen frisch für jede Isolation. Wenn aufgelöst, Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung für die Verdauung.
  3. 50 mM Calciumchlorid in destilliertem Wasser. Filter durch einen 0,2 uM Filter mit einer Porengröße zu sterilisieren.
  4. Maus Speicheldrüse (MSG) Kulturmedium: DMEM: F12 mit Penicillin (100 IU / mL), Streptomycin (100 ug / mL), Glutamax (2 mM), epidermal growth factor-2 (20 ng / mL), Fibroblasten-Wachstumsfaktor -2 (20 ng / mL), N2 gegen Aufpreis (1%), Insulin (10 ug / ml) und Dexamethason (1 pM).

2. Mechanische und enzymatische Verdauung Tissue

  1. Wiegen Sie die seziert Speicheldrüsen.
  2. Hacken Drüsen zu einem homogenen Brei mit sterilen gebogenen Dissektion Schere in einer kleinen Petrischale.
  3. Sammeln Sie zerkleinerten Gewebes in 14 ml-Röhrchen mit 1 ml Puffer pro 80mg submandibularis Gewebe. Spülen Sie die Petrischalen sauber von Gewebe mit einigen der Puffer.
  4. Add another 1 ml Puffer pro 80 mg Gewebe, von 25 ul Kollagenase II Enzymlösung, 25 ul Hyaluronidase Enzymlösung und 250 ul Calciumchlorid-Lösung pro 80 mg Gewebe gefolgt. Wenn die Arbeit mit großen Mengen von Gewebe, Schritte von 2,4 bis 2,9 in T25 Zellkulturflaschen für die Bequemlichkeit durchgeführt werden kann.
  5. Inkubieren in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie Rohre und verreiben mit einer Pipette auf Enzym gründlich mischen durch das Gewebe wieder.
  6. Ersetzen Sie im Wasserbad für weitere 20 Minuten.
  7. Sammeln Gewebe durch Zentrifugation bei 400 xg für 8 Minuten. Überstand.
  8. Resuspendieren in 2 ml Puffer für je 80 mg Gewebe, und wiederholen Enzym und Calciumchlorid zusätzlich wie oben beschrieben. Inkubieren 20 Minuten in Schüttelwasserbad. Entfernen Sie Rohre und verreiben durch eine Pipette, um Enzyme gründlich zu mischen.
  9. Inkubieren letzten 20 min in Schüttelwasserbad. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wie oben, Überstand verwerfen.

3. Waschschritte

  1. Resuspendieren je 80 mg Gewebe in 2 mL Puffer und Pipette, um Gewebe frei von Enzymen zu waschen.
  2. Centrifuge wie zuvor zu sammeln. Überstand.
  3. Wiederholen Sie waschen mit 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe. Centrifuge zu sammeln, Überstand verwerfen.

4. Filtering

  1. Resuspendieren Gewebe Lösung in 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe.
  2. Add-Lösung bis 100 um Porengröße Filter über 50 mL Falcon-Röhrchen platziert. Nicht mehr als 3 ml zerkleinerte Gewebe Lösung pro Spalte, die als Filter blockiert werden. Lassen Sie die durchsickern. Entfernen Sie gefilterte Material hängen an der Unterseite des Filters durch eine Pipette, und fügen Sie Filtrat.
  3. Verwenden Spritze mit 26-Gauge-Nadel, um Filtrat von 50ml Röhrchen nehmen und gelten bis 50 Mikrometer Porengröße Filter auf 5 ml Tuben. Lassen Sie die Filter, durch, unterstützt durch Lösen Deckel, wenn nötig.
  4. Zentrifugenröhrchen wie zuvor zu sammeln. Überstand.

5. Plating-und Mittelbetriebe

  1. Kombinieren Sie alle Pellets in einem Band. Graf mit automatisierten Zelle Zähler oder Hämocytometer.
  2. Platte Zellen bei einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte, oder 2,67 x 10 6 Zellen pro T25 Zellkulturflasche. 1 ml MSG Medium in jede Vertiefung oder 6 ml in jedes T25 Kolben.
  3. Inkubation bei 37 ° C. Spheres muss deutlich sichtbar von Tag 2.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Nach zwei Minuten vor drei Tagen in Kultur werden kleine Aggregate von Zellen (salispheres) werden in den Kulturen deutlich. Salispheres wird weiterhin in der Größe über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur zu züchten. Vertreter Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von salispheres sind in Abbildung 1 dargestellt. Proliferierenden Zellen, die Stammzellen-assoziierte Markerproteine ​​können aus diesen Bereichen isoliert werden, optimal zwischen Tage 3-5 post Isolation und sind in der Lage Differenzierung in funktionale, Speichel produzieren Azinuszellen.

Abbildung 1
Abbildung 1. Salisphere Bildung in vitro. Nach der mechanischen und enzymatischen Aufschluss über die vorliegende Protokoll, können Kugeln mit zunehmender Größe in der schwimmenden Kulturen gefunden werden. Panels sind repräsentativ für die Phasenkontrast-Mikroskopie Bilder von Kugeln von Tagen 0 (A), 4 (B), 7 (C) und 10 (D). Balken = 50 um.

Discussion

Die Gewebekultur hier beschriebene Methode stellt eine reproduzierbare Protokoll für die Isolierung von Stammzellen mit salispheres aus den Speicheldrüsen der Mäuse. Studien unter Verwendung von Zellen auf diese Weise isoliert wurden, die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüse Stammzellen Zellen 9 hervorgehoben. Die Transplantation von hundert von c-Kit +-Zellen aus dem salispheres abgeleitet induzierte funktionelle Erholung von bestrahlten Maus Speicheldrüsen. Diese Daten sind spannend und bieten einen Ausgangspunkt für die Untersuchung von Stammzell-Therapie für Xerostomie. Viele Wege bleiben jedoch untersucht werden, einschließlich der vollständigen Markerprotein Expressionsprofil der Stammzellen, die Fähigkeit der submandibularis, um die Funktion der bestrahlten Parotis Speicheldrüsen und umgekehrt zu retten, und die Charakterisierung der putativen in vivo Stammzellnische der der Zellen. Letztlich ist die Übersetzung dieses Protokoll für die menschliche Gewebeproben und die anschließende Potenzial für die Therapie der Xerostomie bei menschlichen Patienten unter Verwendung der isolierten Zellen der aufregendsten Anwendung der beschriebenen Methode.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506 Store at – 20 °C
Collagenase II GIBCO, by Life Technologies 17101-015 Store at 4 °C
Epidermal Growth Factor-2 Sigma-Aldrich E9644 Make a stock of 10 μg / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at – 20 °C in single use aliquots.
Fibroblast Growth Factor-2 Sigma-Aldrich F0291 Make stock of 25 μg / mL in PBS. Store at – 20 °C in single use aliquots.
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048 As manufacturer instructions.
Insulin Sigma-Aldrich I6634 Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
100 μM pore-size sterile cell strainers BD Biosciences 352360
Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 μM pore size) BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vissink, A. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).
  2. Napeñ, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth). Odontology. 97, 76-83 (2009).
  3. Denny, P. C. Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland. 235, 475-485 (2005).
  4. Man, Y. G. Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat. J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).
  5. Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation. Differentiation. 79, 120-130 (2010).
  6. Eirew, P. A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability. Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).
  7. Gorjup, E. Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations. European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).
  8. Alonso, L., Fuchs, E. Stem cells of the skin epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).
  9. Lombaert, I. M. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).
  10. Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage. Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).

Comments

8 Comments

  1. This is an urgent need for patients who had cancer radiation therapy.
    When are clinical trials on humans expected to commence?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 25, 2011 - 8:43 AM
  2. We are working at the moment on the translation of our stem cell isolation technique to human salivary gland tissue, and are characterising the stem cell-like attributes of these isolated cells. We hope to achieve translation of the technique to the clinical setting for use for therapy of xerostomia in human patients by ²017.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    April 26, 2011 - 7:46 AM
  3. Why not earlier?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 25, 2011 - 7:38 AM
  4. Mrs Pringle,How do you think ,Is it possible to be created or regenerated salivary glands if they were destroyed.
    I have atrophyc rhinopharyngitis.My salivary glands in the mouth are working ,but these on my throat were destroyed after incorect treatment over them and as a result of this
    I have lost my salivary glands in this area.Due to this I have a lot of health problems, and my hope is the scientists to discover a way of transplantation of salivary glands,using these glands ,that still are working.
    How do you think ,Is it possible?
    Thank you!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 24, 2011 - 10:43 AM
  5. Dear Jana,

    Sorry to hear about your problems.
    We are focusing our research at the moment on providing at therapy for xerostomia in the major salivary glands of humans. This potential therapy is looking very promising. We work with these glands because they are the ones most commonly affected by radiation treatment. They are also large and easy to locate and work with.

    As far as we are aware, no-one is trying to develop a therapy for the minor salivary glands. This is mostly due to their high number and very small size - there are over 600 of them scattered throughout the oral cavity and throat. This would make a cell transplantation approach very challenging.

    So although I would love to be able to tell you that a stem cell-based therapy for xerostomia resulting from dysfunction of the minor salivary glands is in process, I think this is unlikely, I would not like to leave you with unrealistically high hopes!

    Regards,

    Sarah.

    Reply
    Posted by: Sarah P.
    October 31, 2011 - 4:31 AM
  6. Dear Sarah,
    thank you very much for your replay!

    The news are bad for me and maybe I couldn't see my small children grown up,but I believe that one day
    scientists like you will discover a way of solvetion of this serious problem.
    There are many people that suffer Seogren-sindrom and Empty nose(atrophic rhinitis),there is a web site "Empty nose sindrome association".I think ,if one day will be find a cure,many peopele would be saved!

    One more time,thank you for spared time!
    I wish you all the best and great success at your work!!!!
    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:14 AM
  7. Dear Jana,

    My wife was diagnosed with a metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma The primary was found deep in her throat at the base of the tongue. Radiation therapy commenced on ²² January ²007 with the last treatment on 5 March ²007. She received a relatively high radiation dose of 6,000 cGy on the sides and 6,500 cGy in the centre. Consequently she had the usual side effects of a permanent dry mouth and throat, sore tongue, sensitive and painful teeth and gums, difficulty swallowing even soft food, etc. The oncologist said that the salivary glands will never recover if they have not recovered even partially over a ² year period.

    During October this year, 4 years and 7 months after her last radiation treatment, her saliva returned in one day; not gradually. The doctors don²17;t know why. One guess is her high protein diet of milk, yogurt, cheese, etc. but its just a guess not based on any science.

    Don²17;t loose hope
    Regards
    Paul http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/²0698985 http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-²407-10-417.pdf Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration
    Abstract
    Background: Radiotherapy for head and neck cancer results in severe and chronic salivary gland dysfunction in most individuals. This results in significant side effects including xerostomia, dysphagia, and malnutrition which are linked to significant reductions in patients²17; quality of life. Currently there are few xerostomia treatment approaches that provide long-term results without significant side effects. To address this problem we investigated the potential for post-therapeutic IGF-1 to reverse radiation-induced salivary gland dysfunction.

    Methods: FVB mice were treated with targeted head and neck radiation and significant reductions in salivary function were confirmed 3 days after treatment. On days 4-8 after radiation, one group of mice was injected intravenously with IGF-1 while a second group served as a vehicle control. Stimulated salivary flow rates

    Conclusions: Post-therapeutic IGF-1 treatment restores salivary gland function potentially through normalization of
    cell proliferation and improved expression of amylase. These findings could aid in the rational design of therapy protocols or drugs for the treatment of radiation-induced salivary gland dysfunction in patients who have completed their anti-cancer therapies.

    Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) also known as somatomedin C is a protein that in humans is encoded by the IGF1 gene.

    IGF-1 is produced primarily by the liver as an endocrine hormone

    In rat experiments the amount of IGF-1 mRNA in the liver was positively associated with dietary casein and negatively associated with a protein free diet.
    IGF-1 then stimulates systemic body growth, and has growth-promoting effects on almost every cell in the body, especially skeletal muscle, cartilage, bone, liver, kidney, nerves, skin, hematopoietic cell, and lungs. In addition to the insulin-like effects, IGF-1 can also regulate cell growth and development, especially in nerve cells, as well as cellular DNA synthesis.
    ---------
    Casein
    From Wikipedia, the free encyclopedia
    Jump to: navigation, search
    For information about casein usage in artistic painting, see Casein paint.
    Casein (pronunciation: /G²;keɪsiɪn/, from Latin caseus, "cheese") is the name for a family of related phosphoprotein proteins (αS1, αS², β, κ). These proteins are commonly found in mammalian milk, making up 80% of the proteins in cow milk and between 60% and 65% of the proteins in human milk. Casein has a wide variety of uses, from being a major component of cheese, to use as a food additive, to a binder for safety matches. As a food source, casein supplies amino acids; carbohydrates; and two inorganic elements, calcium and phosphorus
    --------------------------------------------

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 2, 2011 - 10:58 AM
  8. Dear Paul,

    thank you for your letter ,your support and advices!
    I fight everyday to make my health condition beter, becouse I have children and they need me!But now I have atrophic rhinitis due to atrophic pharingiitis and day after day it becomes harder and harder to cope with this really
    serious problem!Despite every medical data I don't lose hope,becouse when there aren't any others possibilities ,the faith is the most important thing that can help us and give us strength!

    I hope that your wife is fine now ,after partly recovering of her salivary glands!I wish your family whole the hapiness in the world and the most important thing-"Health",you deserve these thinngs!!!!

    Paul,if you learn something new at this area of medicine,I beg you to write me!Here is my e-mail: tisho²001@mail.bg.

    regards:Jana

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 10:18 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics