Förbättrad visualisering och kvantitativ analys av läkemedelseffekter Använda Micropatterned celler

Bioengineering
 

Summary

Självhäftande micropatterns att normalisera cellulära arkitektur kan användas för att öka känsligheten i detektion av läkemedelseffekter, förbättra reproducerbarhet och förenkla automatisk bildtagning och analys. Sådan teknik kommer att gynna drog / siRNA screening analyser, som utförs på konventionella stöder cellkulturen och därmed lider av överdriven cell-till-cell variabilitet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Degot, S., Auzan, M., Chapuis, V., Béghin, A., Chadeyras, A., Nelep, C., Calvo-Muñoz, M. L., Young, J., Chatelain, F., Fuchs, A. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514, doi:10.3791/2514 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hittills är de flesta HCA (High Content Analysis) studier som genomförts med tillhörande cellinjer som odlats på ett homogent substrat i vävnad-kultur behandlas mikro-plattor. Under dessa förhållanden, celler sprida och dela i alla riktningar vilket resulterar i en naturlig variabilitet i cell form, morfologi och beteende. Den höga cell till cell variansen i den totala populationen hindrar framgång HCA, särskilt för läkemedelsutveckling. Förmåga micropatterns att normalisera form och interna polaritet av varje enskild cell ger en fantastisk möjlighet för att lösa denna kritiska flaskhals 1-2.

För att underlätta tillgången och användningen av micropatterning teknik, har CYTOO utvecklat ett sortiment av färdig att använda micropatterns, finns i täckglas och brunn format. I denna video artikeln ger vi detaljerade protokoll över alla rutiner från cell seedning på CYTOOchip micropatterns, läkemedelsbehandling, fixering och infärgning till automatiserade inköp, automatiserad bildbehandling och slutlig analys av data. Med detta exempel visar vi hur micropatterns kan underlätta cellbaserade analyser. Förändringar av cellen cytoskelettet är svåra att kvantifiera i celler odlade på homogent substrat, men odling celler på micropatterns resulterar i ett reproducerbart organisation av aktin meshwork på grund av systematiska placeringen av kontakterna celladhesion i varje cell. En sådan normalisering av intracellulära arkitekturen gör kvantifiering av även små effekter på aktin cytoskelettet vilket framgår av dessa uppsättning protokoll med blebbistatin, en hämmare av aktin-myosin interaktion.

Protocol

1. Cellberedningen och såmaskiner på Micropatterns

  1. Placera 2 CYTOOchips i 2 oberoende brunnar på en 6 brunnar se till att du läser "CYTOO" i det nedre högra hörnet av CYTOOchip. Micropatterns kan fluorescerande med Cy3 eller Cy5 färgämnen. CYTOOChips används för detta experiment har Cy3 fluorescerande micropatterns.
    VARNING: Håll marker i mörkret.
  2. Samla HeLa celler (~ 80% konfluenta) med trypsinization. Kontrollera i mikroskop att celler på rätt sätt sprids av trypsin behandling. Samla och centrifugera celler vid 300g i 4 minuter, sedan försiktigt resuspendera cellpelleten. Räkna celler och späda till en koncentration på 15.000 celler / ml i klar DMEM/F12 kultur media.
  3. Fördela 4 mL (60.000 celler) i varje brunn som innehåller en CYTOOchip.
    VARNING: Plattan bör flyttas så lite som möjligt för att undvika att framkalla några roterande rörelser i mediet eftersom det tenderar att koncentrera cellerna i centrum.
  4. Låt cellerna sediment i 10 min under huven sedan flytta dem till cellen inkubatorn. Efter 10-20 min, kommer cellerna att börja följa micropatterns. Efter 10 minuter, kontrollera regelbundet under mikroskop.
  5. Så snart celler har fäst, ändra cellen mediet och försiktigt spola täckglas ytan på följande sätt:
  6. Hålla plattan platta försiktigt aspirera mediet med en pipett från sidan av brunnen.
    VARNING: Låt aldrig chip torka ut, innebär detta aldrig aspirera ut all vätska men lämna tillräckligt för att täcka CYTOOchip hela tiden.
  7. Tillsätt 4 ml PBS och aspirera på nytt man börjar i mitten av chipet sedan flytta till sidan av brunnen. Sug bort PBS som beskrivs utan att utsätta chip till luft. Upprepa 3-4 gånger.
  8. Kontrollera under mikroskop för flytande celler:
    • Om ett stort antal flytande celler kvar, tvätta på samma sätt.
    • Om du ser mycket få celler, aspirera bort en del av PBS och ersätta det med 2 ml färskt medium. Aspirera och tillsätt 4 ml rent medelstora två gånger.
  9. Placera plattan i en vävnadsodling inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2 i minst tre timmar för att cellerna för att uppnå full spridning.
    OBS: Med denna metod mellan 10-30% (2000-6500) micropatterns kommer att bebos av en enda eller flera celler.
    VARNING: Den tid som behövs för celler att hålla sig före tvätt och den tid som behövs för fullständig spridning av celler micropatterns kommer att bli specifika för varje cellinje.

2. Blebbistatin Behandling

  1. Lös blebbistatin i 100% DMSO att få en stamlösning av 17 mm. Späd stamlösningen vidare till 5 mm med 100% DMSO. Gör en slutlig utspädning i odlingsmedium för att få en slutlig koncentration av 5 mikroM blebbistatin i 0,1% DMSO.
  2. För styrning förhållanden, förbereda 4 ml medium innehållande 0,1% DMSO bara.
  3. Sug media på celler och ersätta den med 4 mL mediet förberedda för behandlade och kontroll förhållanden.
  4. Inkubera cellerna för 1 timme vid 37 ° C.

3. Cell Fixering och färgning av Actin

  1. Beredning av lösningar för cell fixering
    Se reagens avsnitt för beredning av cytoskelettet buffert (CB) och PFA 5%. CB rekommenderas särskilt för fluorescens märkning av aktin filament och mikrotubuli.
    • Förbered 1xCB-sackaros: tillsätt 1 g sackaros till 2 mL CB.
      Införande av sackaros hjälper till att bevara den interna cellstrukturer.
    • Förbered 4% PFA-CB-sackaros: Tillsätt 1 mL 1xCB-sackaros till 4 ml varmt PFA 5%.
      VARNING: Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C under några dagar bara.
  2. PFA fixering
    • Använd pincett för att plocka upp CYTOOchip på CYTOO logotyp och placera den (utan tvätt) i en brunn i en 6-brunnar innehållande 2 ml 4% PFA-CB-sackaroslösning
    • Inkubera 10 minuter vid RT
    • Ta bort PFA-CB-sackaros och tvätta en gång med PBS
    • Gör en andra tvätt med 2 ml 100 mM NH 4 Cl i 10 min för att släcka kvarvarande PFA crosslinking aktivitet
      OBS: PFA fast bilderna kan lagras i PBS i flera dagar vid 4 ° C innan organell färgning för lysrör avbildning.
  3. Permeabilization av cellmembranet med Triton X-100
    Permeabilization av celler med tvättmedel gör antikroppar eller andra sonder att penetrera cellmembranet och eliminerar vissa av cytosolic pool av cytoskelettet proteiner som annars kan minska kontrasten cytoskelettala polymerer vilket gör det svårt att analysera deras lokalisering.
    • Ta bort NH 4 Cl och tillsätt 2 ml / brunn på 0,1% Triton X-100-CB i 3 min vid RT
    • Tvätta två gånger med 2 ml PBS
  4. Aktin färgning
    Lysrör-phalloidin som binder till infödda aktin bara används för att färga aktin filamenTS.
    • Tillsätt 2 ml FITC-konjugerat phalloidin utspädd 1:2000 i PBS med 1,5% BSA
    • Inkubera 1 timme vid RT
    • Tvätta en gång med 2 ml PBS
  5. Nuclei färgning
    • Tillsätt 2 ml Hoechst (fläcken med 1μg / ml i PBS)
    • Inkubera 3 min vid RT
    • Tvätta två gånger med 2 ml PBS
  6. Montering av bild
    • Plocka upp CYTOOchips på CYTOO logotyp och montera CYTOOchip på en standard objektsglas med 25-30 mikroliter av Mowiol eller någon annan monteringslösning.

4. Mikroskop inställning och automatisk Image Acquisition

Många bildbehandlingsprogram paket finns som styr mikroskop för snabb automatisk bildtagning och display. Detta exempel använder metamorfa bildbehandlingsprogram och automatisk förvärv utförs på en Nikon Eclipse Ti mikroskop utrustad med en CCD Hamamatsu kamera och en Intensilight kvicksilver-fiber belysning. Bilderna förvärvas till 20x förstoring i tre våglängder motsvarande DAPI (kärnor), Cy-3 (micropatterns) och FITC-Phalloidin (aktin). Antalet micropatterns visualiseras per fält kommer att variera beroende på kameran och inställningar mål. CYTOO micropatterns är placerade vid förutbestämda intervaller från varandra (100 eller 130 mikrometer) över chip kraftigt underlätta förvärv.

  1. Välj 20x förstoring
  2. Öppna Multidimensional Förvärv (i menyraden: Apps / Multidimensional Acquisition) och ställa in olika parametrar av experimentet:
    • Antal våglängder: 3
    • Våglängd typer: DAPI, FITC, Cy3
    • Ställ in exponeringstid för varje våglängd genom att först fokusera på ett område av celler
    • Autofokus kan utföras på varje våglängd
    • Välj var du vill spara data
  3. Välj Cy3 våglängd och placera kameran så att 12 micropatterns visualiseras och centrerad i kameran fältet (4 kolumner och 3 rader av mönster).
  4. Skapa en tidskrift som kör flerdimensionella Acquisition. Proceduren för att skapa en tidskrift beskrivs i figur 1.
  5. Öppna Scan skede funktion (i menyraden: Enheter / Scen / Scan Stage). Att förvärva 24 bilder som vardera innehåller 12 micropatterns vid 20x förstoring, skriv 6 kolumner och fyra rader med -400 ìm X steglängd och 300 ìm Y steg storlek. I Ställ tidning för att köra, ladda upp tidskriften MDA.JNL. Tryck sedan på Skanna för att starta den automatiska förvärvet av hela kvarteret i tre våglängder.
    OBS: X och Y steg storlekar anges här kommer att variera beroende på antalet micropatterns närvarande i en kamera fält. Beroende på din scenen inrätta riktning i X och / eller Y kan kräva negativa värden för rörelse i rätt riktning.

5. Automatisk bildbehandling och analys

Många bildbehandling och analys programpaket finns. De förfaranden som beskrivs nedan bearbetning beskriva bilden och steg analys utförd av 2 skräddarsydda makron skrivna för öppen källkod programmet ImageJ. Den första makro CellRef skapar en referens cell, den andra hypotenusan åtgärder styvhet / kollaps av cellmembranet. Båda finns tillgängliga på begäran via www.cytoo.com .

  1. Skapa Bildstaplar för alla tre kanalerna centrerad på micropatterns (makro CellRef).
    Användning av micropatterns undviker cell klustring och klumpar, kraftigt förenkla det första steget i automatiserad bildbehandling som är lokalisering och segmentering av enskilda celler. Den fluorescerande micropattern bilder används för att definiera och avgränsa regioner inriktad på micropatterns. Dessa regioner är sedan införlivas på bilderna som förvärvats i andra kanaler och beskäras. Motsvarande beskurna bilder monteras sedan ihop till högar för varje våglängd. En RGB-stack skapas också från kopplingen av de tre kanaler (figur 2).
  2. Tillämpa ett filter cellmarkeringen (makro CellRef)
    Som nämnts ovan, är 10-30% (2000-6500) av micropatterns ockuperad av en enda cell eller flera celler, medan resterande micropatterns är tomma. För att välja bilder som visar micropatterns upptas av bara en enda cell, upptäcker makrot antalet kärnor per bild och eliminerar från alla staplar (RGB och olika våglängder) sådana som har mer än en kärna eller inga kärnor (Figur 3).
  3. Eliminera icke-normaliserad och celler som inte är fullt utsträckt över micropattern med cut-off cellområdet filter (makro CellRef)
    För att ta bort delande celler som skulle ha undgått kärnorna filter, annat filter med FITC-kanal för aktin tillämpas. Cell ytan beräknas och de som under en viss avskurna (cellområden cirka 2 gånger mindre än interfas cell-området) tas bort från alla skorstenar. Cellen kuvertet område bestäms av storleken på mönstret.
  4. Rikta cellbilder (makro CellRef)
    Från de tidigare stegen, bilder som innehåller enstaka micropatmönstrad celler valdes ut. Även om dessa bilder är centrerad på micropatterns, de är aldrig alla perfekt anpassade till varandra. För att avsluta Bildbehandling, en ImageJ plugin (MultiStackReg) tillämpas för att omstrukturera alla insamlade bilder och alla kanaler baserat på micropattern position. Detta steg skapar anpassade staplar av individuella bilder som nu kan användas för enskild cell analys eller skapande av en referens cell (Figur 4)
  5. Bygga en referens Cell (makro CellRef)
    Växande celler på micropatterns innebär att alla celler har liknande former. Denna normalisering möjliggör en exakt justering och överlagring av många celler bilder. Sammanfattningsvis signalen i varje bild över hela stacken gör att man kan visualisera och mäta en "genomsnittlig läkemedelseffekt". Den slutliga övergripande bild eller Referens Cell är ett unikt och användbart verktyg för representation och bildanalys och kan bara uppnås med micropatterned celler (Figur 4). I ImageJ är hänvisningen Cell konstrueras genom att göra en projektion av den filtrerade och anpassats bilder från en skorsten (Bild> Staplar> Z-projektet). Flera projektion metoder kan tillämpas, till exempel genomsnittlig eller maximal intensitet men oftast en median-projektion väljs vilket eliminerar främsta extremvärden av bilden stacken. För att underlätta granskning av resultaten, är en LUT (Look Up Tables) konvertera monocolor bilden i en färgkodad frekvens karta tillämpas.
  6. Mäta och kvantifiera parametrar av intresse (makro hypotenusan)
    I denna video artikeln, är L-micropatterns används eftersom den form anordnar aktin cytoskelettet i en enda stor stress fiber. Genom att lyfta fram aktin på detta sätt kan blebbistatin påverkan på cytoskelettet bestämmas på många sätt: att mäta förändringar i krökning av aktin stressen fiber, färgningsintensitet, längd eller tjocklek av stress fiber, förändringar i morfometriska funktioner i aktin filament eller cellens form etc. Dessa parametrar kan mätas antingen på enskilda celler bilder eller på den slutliga Referens Cell själv.
    Här var effekten av 5 mikroM blebbistatin kännetecknas av att räkna antalet kollapsade celler med en andra ImageJ makro som heter hypotenusan (Figur 7). Kortfattat är thresholded bilder av L-micropattern används för att definiera en teoretisk hypotenusa i cellen triangel form. Därefter är tröskling av bilderna aktin färgade utförs för att närma själva cellen form. Området mellan den teoretiska hypotenusan i cellen triangeln och den faktiska konkava cellmembranet Därefter mäts. När cellen har kollapsat, visas ett område under den teoretiska hypotenusan. Andelen kollapsade celler används för att jämföra kontroll och behandlas förhållanden.

6. Representativa resultat

Exempel på vad cellerna ska se ut på micropatterns omedelbart och flera timmar efter den kritiska tvätt åtgärder som beskrivs i 1,6-1,8, visas i Figur 5. Efter 15 min på CYTOOchips, är runda HeLa celler observeras på samma avstånd som anger att de har anslutit sig till fibronektin micropatterns (Figur 5a). Vidhäftning är klar när cellerna förblir orörlig trots försiktig skakning av kulturen fartyget. För att minimera antalet micropatterns upptas av flera celler, är chips sen sköljas med PBS för att avlägsna celler flytande över cytophobic områden. Efter flera timmar kommer celler som är fullt utsträckta över micropatterns ser ut som de som visas i figur 5b.

Typiska enda cell bilder tagna efter inkubation av celler med blebbistatin, fixering och färgning av aktin och kärnor presenteras i Figur 6. Efter automatiserad förvärv av flera bilder och bildbehandling med hjälp av ImageJ CellRef makro är en färgkodad frekvens karta genereras som visar intensiteten av aktin genomsnitt för alla celler bilder (Figur 6c och 6f). Jämförelsen av referenscellen för nontreated och behandlas förhållanden visar potentialen i detta tillvägagångssätt för enkel observation av fenotyp i studien och är särskilt användbart för att utforska cellulära läkemedelseffekter.

Ett exempel på en möjlig analys av effekterna av blebbistatin på celler visas i Figur 7. Antalet kollapsade celler (dvs celler med ett tomt område som existerar enligt den teoretiska hypotenusan) upptäckts i 50 kontroll celler och 50 celler som behandlats med 5 mikroM blebbistatin som upptäcks av ImageJ hypotenusan makro visas. Det ökade antalet kollapsade celler i behandlade blebbistatin befolkningen speglar uppmjukning av den stress fibrer och därmed spänningar i membranet på grund av blebbistatin hämning av aktinomyosin kontraktil krafter inom cellen.

Figur 1
Figur 1. Förfarande för att skapa en ny tidskrift med metamorfa.

Figur 2
Figur2. Flödesschema för automatisk bildbehandling förfarande.

Figur 3
Figur 3. Filtrering av enskilda celler.

Figur 4
Figur 4. Bygga en referens Cell.

Figur 5
Figur 5. Cell sådd. A) Hela celler följt micropatterns efter spolning steg (4x förstoring) B) HeLa celler efter full spridning på L micropatterns (10x förstoring).

Figur 6
Figur 6. Jämförelse nonpatterned och micropatterned celler i kontroll och droger behandlas förhållanden. HeLa celler var seedade i 3 timmar och behandlas med 5 mikroM blebbistatin under 1 timme (undre panelen) eller lämnas obehandlad (övre panelen). I kontroll nonpatterned celler (en), monterar aktin i flera fibrer som isär omärkligt vid behandling med 5 mikroM blebbistatin (d). På L-micropatterns, kontroll celler anta en triangulär form (b) och utveckla en stor aktinfibern (stress fiber) mellan 2 apices av L. Jämfört med nonpatterned celler (d), inducerar blebbistatin en stor fenotypisk förändring på L-micropatterned celler (e). Direkt visualisering av läkemedelseffekter och jämförelsen av kontroll och behandlade förhållanden kan visualiseras snabbt med referenscellen presentationen byggd av 20 celler. I likhet med enskilda celler, är en tydlig och intensiv stress fiber som finns på kontroll Referens Cell (c), medan blebbistatin behandlade cellerna kollaps och de stora stressen fibrer försvinner (f).

Figur 7
Figur 7. Exempel på en analys av effekterna av blebbistatin på celler med hjälp av makrot Hypothenuse. Medan 25% av kontroll celler kollapsade, var den ökade 3 gånger till 75% i 5 mikroM behandlas blebbistatin celler som återspeglar den försvagade aktinomyosin kontraktila nätverk (n = 50 celler).

Discussion

Val av micropattern

Medan effekterna av 5 mikroM blebbistatin är knappt mätbar på standard kulturen stödjer, är effektiv kvantifiering möjligt på micropatterns som koncentrerar aktin i en enda stor stress fiber. Detta ökar visualisering av aktin cytoskelettet hjälpa exakt kvantifiering av blebbistatin effekter på cellen. Valet av micropattern form är avgörande för utformningen av analysen och är utformad enligt de fenotypiska förändringar som bör lyftas fram i studien.

Slutsatser

Micropatterns underlättar visualisering och kvantifiering av läkemedelseffekter, speciellt vid låga koncentrationer. Utbyte av homogen plana underlag med lim micropatterns för cell-baserade analyser ökar noggrannheten, känsligheten och kvaliteten på uppgifter som framställts. Följaktligen är färre celler som behövs för analys för att uppnå robusta statistiska resultat 3. Självhäftande micropatterns erbjuda ett verkligt tillfälle att förbättra funktionella studier och undersöka fenotypiska förändringar vid lägre koncentrationer för att undvika att framkalla toxiska eller indirekta läkemedelseffekter. Om adekvat screening plattformar används, kan micropatterns möta kraven från läkemedelsföretag för att förbättra gen / drug screening program. Några ytterligare exempel på de senaste publikationer som har utnyttjat micropatterns för att analysera och kvantifiera cellulära fenomen som citeras nedan 3-13.

Disclosures

Alla författare utom Anne Béghin är anställda av CYTOO SA, som tillverkar reagens och instrumentering presenteras i denna artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CYTOOchips 20x20 L-M-FN CYTOO 10-114 CYTOOchips are available for adsorption of the protein of your choice
PBS 1x GIBCO, by Life Technologies 14040-091
Counting chamber (Kova slide) Prolabo 71287.01
DMEM/F-12 + Glutamax-I GIBCO, by Life Technologies 25300-054
FBS (f tal bovine serum) PAA Laboratories 31331-028
Penicillin & Streptomycin PAA Laboratories A15-101
6 wells-plate Dutscher 353046
centrifuge Fisher Scientific M65838
Microscope Nikon Instruments
Cytoskeleton Buffer 1X (CB) Sigma-Aldrich MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 10 mM MES pH 6.1, 138mM KCl,
3mM MgCl,
2mM EGTA
Sucrose Sigma-Aldrich S2395
PFA 32 % Electron Microscopy Sciences 15714
PFA 5% Mix 10 mL of PFA 32% with 54 mL of CB 1.185X
Triton-X100 Sigma-Aldrich T9284
PBS tablets GIBCO, by Life Technologies 18912-014
Bovin serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7806
Phallodin-FITC Sigma-Aldrich P5282
H–scht Invitrogen H3570
Blebbistatin Euromedex BN0640
DMSO Sigma-Aldrich D8418
NH4Cl 0.1M Sigma-Aldrich M11209
Epifluorescent microscope Nikon Instruments Eclipse Ti
CCD Camera TBC TBC
ImageJ Software http://rsbweb.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, M. The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).
  2. Thery, M. Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).
  3. Schauer, K. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nat Methods. (2010).
  4. Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape. Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).
  5. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
  6. Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity. J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).
  7. Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction. J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).
  8. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).
  9. Kwon, M. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).
  10. Nelson, C. M. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).
  11. Pouthas, F. In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum. J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).
  12. Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation. Nature. 447, 493-496 (2007).
  13. Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics