Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Введем целом монтажа иммуногистохимии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с несколькими маркировки для анализа сложных сосудистых формирование сети в мышиных эмбриональных коже конечностей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, W., Mukouyama, Y. Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo. J. Vis. Exp. (51), e2620, doi:10.3791/2620 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для работы с изображениями всего сосудистая сеть имеет решающее значение для понимания клеточных механизмов ветвления морфогенеза. Мы разработали сосудистой коже конечностей модель для изучения развития сосудов, в которых уже существующих примитивных капиллярного сплетения реорганизован в иерархически разветвленной сосудистой сети. Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки позволяет надежной визуализации интактных кровеносных сосудов, а также их клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, перицитов и гладкомышечных клеток, с использованием специфических флуоресцентных маркеров. Достижения в этой сосудистой коже конечностей модель с генетические исследования лучшему пониманию молекулярных механизмов развития сосудов и кучность стрельбы. Сосудистой коже конечностей модель была использована для изучения того, как периферические нервы обеспечивают пространственную шаблон для дифференциации и структурирования артерий. Это видео статье описан простой и надежный протокол пятно нетронутыми сосуды с сосудистыми специфических антител и флуоресцентного вторичными антителами, которая применима для васкуляризированной органов эмбриональных, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов.

Protocol

1. Сбор мышиных эмбриональных кожи конечностей (E13.5 ~ E17.5)

  1. Эвтаназии подключен самок утвержденной процедурой. По нашим утвержденный протокол животных, самки эвтаназии СО 2 воздействия, а затем обеспечивается шейки дислокации. Положите животное на своих абсорбирующих бумажное полотенце и положите его полностью в 70% EtOH / H 2 O из бутыли.
  2. Рассекать матку нетронутой и поместить его в 100 х 15 мм чашки Петри содержащих сбалансированный солевой ледяной Хэнкса Решение (HBSS), чтобы смыть кровь.
  3. Отдельный и анализировать эмбриона. Удалить очень тонкие амнион из эмбриона.
  4. (Опция) Рассеките одного эмбриона в 35 х 10 мм блюдо Петри, если каждый эмбрион необходимо генотипирование. Расчлененный хвост передается 0,2 мл ПЦР трубка для генотипирования.
  5. Отрежьте передние конечности эмбриона и передачи передние конечности от кольца щипцов в 24-луночный планшет, содержащий 2 мл ледяной свежей 4% Параформальдегид (PFA) в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS).
  6. Fix передние конечности с нежным перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи.
  7. На следующий день, удалить PFA и мыть три раза в течение 5 мин в 2 мл PBS с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
  8. Передача передние конечности в 100% метанола (метанол) и хранить их при температуре -20 ° C фермент морозильник (морозильная камера с критической контроля температуры и без функции автоматического размораживания). Первичные антитела, перечисленных в таблице 1 работы после 100% MeOH лечения.
  9. Снимите кожу от передних конечностей с использованием тонких пинцетом. Лимб кожи, когда обезвоженной, должен легко отделить от конечностей. Первое место конечности с брюшной стороны (пальмовое сторона) вверх. Затем с помощью тонкой пинцет, разрезать кожу, как показано на видео. Следующая рассекать вокруг всей конечности, шелушение кожи от нежно без каких-либо повреждений.

2. Всего монтажа иммуногистохимического окрашивания конечностей Скины

  1. Увлажняет конечностей шкуры в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки путем инкубации через градуированные серии MeOH / PBT (PBS + 0,2% Тритон Х-100) (75%, 50%, 25%) в течение 5 минут каждый. Обратите внимание, что обмен решения должны быть осторожны, чтобы не повредить конечности скинов.
  2. Мыть два раза в течение 5 мин в PBT с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
  3. Блок конечностей шкуры или с 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для коз вторичными антителами, или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для осла вторичными антителами в течение 2 часов с нежным перемешивания на Nutator смесителя на комнатной температуре.
  4. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl первичных антител (соответствующего разбавления, перечисленных в таблицах) в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS 0,2 TX100% или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Инкубируйте конечностей шкуры с мягким перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи. Обратите внимание, что несколько первичных антител, полученных из различных видов (например, крысы моноклональное антитело + кролик поликлональных антител) могут использоваться одновременно.
  5. На следующий день, место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS 0,2% или 2 TX100 Осел% сыворотки / PBS +0,2% TX100).
  6. Вымойте пять раз в течение 15 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
  7. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl вторичного антитела в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Обычно мы используем вторичные антитела от Джексона ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 разведения) или Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 разведение). Фильтры вторичных решение антител при 0.22μm PVDF мембранных фильтров шприц для удаления агрегированных частиц вторичных антител. Инкубируйте конечностей шкуры в темноте или обернуты алюминиевой фольгой в течение 1 часа с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что различные флуоресцентные сопряженных вторичными антителами, полученных из различных видов могут быть использованы одновременно.
  8. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Вымойте пять раз в течение 15 мин в темноте или обернуты алюминиевой фольгой с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
  9. (Вариант для counterstaining против ядра) Инкубируйте конечностей шкуры с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) с К-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 разбавления) в темное время суток или завернутые с алюминиевой фольгой в течение 10 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной temperatuповторно. Затем вымыть три раза в течение 5 мин с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) в темное время суток или в оболочку из алюминиевой фольги с мягким перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что сильный и специфического окрашивания для ядер наблюдается To-PRO-3 в удельных выбросов (гелий-неоновый 633 нм возбуждение).

3. Монтаж Limb Скины на слайде

  1. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм блюдо Петри. Удаление пыли, кристаллы, волокна от внутреннего слоя шкуры с использованием тонких пинцетом под стереомикроскопа с низкой освещенности, чтобы избежать обширных фото отбеливание.
  2. Передача конечностей шкуры клея микроскопических слайд кольца щипцов. Место кожи с внутренним слоем лежал вверх на слайде (т.е. к покровным). Свести шкуры тщательно с использованием тонких пинцет и удалите переноса моющий буфер Kimwipe.
  3. Горы в анти-Fade монтажа СМИ без пузырьков воздуха. Мы используем 25 "x25" покровным. Лечение на плоской поверхности в темное время суток (например, образцы смонтированы командами Продли Золотой реагента размещены на ночь в темноте при комнатной температуре перед просмотром). Для длительного хранения, печать покровное для слайдов и хранить при 4 ° C.

4. Конфокальной микроскопии

  1. Настройка соответствующих лазеров для флуорофоров. Мы используем Leica TCS SP5 конфокальной микроскопии с тремя лазерных источников, включая Аргон 488nm (для Alexa Fluor 488 и GFP), DPSS 561nm (для Alexa Fluor 568 и Cy3) и гелий-неоновый 633 нм (для Alexa Fluor 633, Cy5 и To-Pro-3) .
  2. Использование последовательного инструмент сканирования, чтобы избежать или уменьшить перекрестные помехи, в котором все красители в двойной или тройной окрашенных образцов будут в восторге, в то же время. В последовательном режиме сканирования изображения будут записаны в последовательном порядке.
  3. Более общие сведения о флуоресцентных красителей и лазеров для возбуждения может быть создан в "конфокальной микроскопии для биологов" по Хиббса (2004)

5. Представитель Результаты

Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии в immnofluorescence мыши лапы кожу на E15.5 с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (рис. 1А-C, D синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (рис. 1А зеленый), и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (рис. 1а, б красный) показало, характерные ветвящиеся структуры αSMA + артерий, в соответствие с 2H3 + периферических нервов конечностей в кожу. В дополнение к ветвления кровеносных сосудов, это сосудистой коже конечностей модель используется для изучения паттернов лимфатический сосуд ветвления с использованием антител к эндотелиальной лимфатической маркер ячейки LYVE-1 (Рис. 1D, E красный) и Neuropilin2 (NRP2) (рис. 1D, F зеленый ).

Рисунок 1
Рисунок 1. (AC) Артерии согласования с периферических нервов в эмбриональной коже конечностей. Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (AC, синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (зеленый) и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (А и В, красный ) показано. На E15.5, 2H3 + периферических нервов (открытые стрелки) ассоциируется с артериями (наконечники стрел), на которые распространяются αSMA + гладкомышечных клеток. (DF) лимфатической сосудистой в эмбриональной коже конечностей. Triple-этикетку конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (D, синий), лимфатических эндотелиальных маркер ячейки LYVE-1 (D и Е, красный) и Neuropilin2 (NRP2) (D и F, зеленый ) показано. Лимфатические сосуды визуализируются как LYVE-1 и NRP2, в то время LYVE-1 выражается также подмножество макрофагов (открытый наконечники стрел). Шкала бар: 100 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сосудистой системы имеет решающее значение для развития органов во время эмбриогенеза, а также для обслуживания органов и репродуктивных функций у взрослых, потому что он поставляет достаточное количество кислорода и питательных веществ к органам. Правильное сосудистой сети хорошо разработана со сложной и многоступенчатой ​​процессов ангиогенеза, в котором уже существующих капиллярной сети реорганизован с весьма разветвленной и иерархические структуры. Несмотря на многочисленные работы, как было показано, что разнообразие молекул, вовлеченных в эти процессы, это не было ясно, как органы или их компоненты обеспечивают сигналы для содействия поэтапный процесс сосудистого эндотелия, включая развитие дифференциации и структурирования сосудистых ветвления. Для решения этого вопроса, соответствующие органы васкуляризированной, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов не требуется. Сосудистой коже конечностей модель с усилением-функции и потерей функции генетических манипуляций позволяет с высоким разрешением анализ развития сосудов.

Мы описываем здесь подробный протокол вскрытия в том числе эмбриональных передние конечности мыши, весь монтаж иммуногистохимического окрашивания и конфокальной микроскопии, который обычно используется в нашей лаборатории для анализа конечностей ангиогенеза кожи и lymphangiogenesis. Протокол обеспечивает воспроизводимость результатов и неповрежденной сосудистой для раннего и позднего эмбрионального кожи конечностей легко изображено конфокальной микроскопии. Он также применим и для взрослого уха кожи сосудистую (Ю. М. и К. Перкинс, не опубликовано). Для дальнейшего изучения изображений динамика крови роста судна и ремонт, однако, и другие модели животное, как данио с флуоресцентно меченных кровеносных сосудов полезна для покадровой визуализации сосудистой в естественных условиях с высоким разрешением.

Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки сосудистыми маркеров позволило крови и лимфатической изображение эндотелиальных клеток, и их соседей в том числе гладкомышечных клеток и перицитов в шкуры. В дополнение к сосудистой антител маркеров (табл. 2), антитела к ген-репортер продукции (β-галактозидазы, β-гал и зеленого флуоресцентного белка, GFP, таблица 2), что повторять экспрессии эндогенных генов Ваш интерес может быть использован. Например, мы использовали лапы кожу от эмбрионов проведения LacZ репортер, ориентированные на ephrinB2 (Wang и соавт., 1998) или EphB4 локус (Gerety и соавт., 1999), которая обеспечивает гистохимических показателей ephrinB2 или EphB4. EphrinB2, трансмембранный лиганд, выражается артерий, но не жил, а его рецепторов, тирозин киназ EphB4 является преимущественно выраженных вен (Wang и соавт., 1998). Всего монтажа иммуногистохимического анализа в лапы шкуры E15.5 ephrinB2 LacZ / + или EphB4 LacZ / + гетерозиготных эмбрионов показало, что периферические чувствительные нервы связаны преимущественно с артериальных сосудов (Mukouyama и соавт. 2002). Эти мыши доступны в лаборатории Джексона (Efnb2 tm1And / J: Лот № 006039, Ephb4 tm1And / J: Лот № 006044).

Изучение различных стадиях эти сосудистой систем показывает, клеточной динамики ангиогенеза включая сосудистые разветвления, артериальной / венозной дифференциации, развития лимфатических сосудов и гладкой мускулатуры / перицитов освещение в развивающихся конечностей кожи. По E13.5, примитивные капиллярного сплетения была создана в конечности кожи, но никакой связи между чувствительных нервов и кровеносных сосудов не наблюдается. По E14.5, сосудистого ремоделирования произошло и нервов связанных с отремонтирован разветвленной сосуды, которые выражают артериальных эндотелиальных клеток и маркеры имеют αSMA + гладкомышечных клеток (Mukouyama и соавт. 2002). Генетические исследования показывают, что периферические чувствительные нервы служить образцом для определения кровеносных сосудов ветвящиеся узоры и артериальной дифференциации (Mukouyama и соавт. 2002). Анализ нерв-VEGF-условное мутантов показал, что нервные происхождения VEGF-A требуется для артериальной дифференциации в коже конечностей сосудистую (Mukouyama и соавт. 2005). Наши результаты также показали, что нервные VEGF-условное мутантов выставки за вычетом обесценения нервных сосудов выравнивания, что свидетельствует привлечение дополнительного ангиогенного фактора (ов). Это говорит о том, что сосудистая сеть кожи конечностей модель позволяет изучать различные механизмы, которые контролируют артериальное дифференциации и структурирования сосудистых ветвления. Кроме того, что контроль дифференциации венозной и структурирование венозный и лимфатический сосуд ветвления по-прежнему остается без ответа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим К. Гилл за помощь в разведении мыши и ухода и для лабораторных управления. Спасибо также Mukoyama лаборатории членов за техническую помощь. Финансирование было предоставлено Внутренние программы исследований Naitonal института здоровья.

Materials

Antibodies

Pan-endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1
PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution
VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution
CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution
Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2

Arterial endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution
Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution

Venous endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution

Lymphatic endothelial cell marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution
LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution
Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution
Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution
Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution
Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution

Smooth muscle cell/pericyte marker

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6
NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution
SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution

Antibodies forGFP reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution
GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution
GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution

Antibodies for LacZ reporter

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution
β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution
β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution

Antibodies for peripheral axon

Antibody Species Company Catalogue # Working condition
2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution
Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution
Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution

Antibodies for migrating Schwann cells

BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution

(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody

#1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody.

#2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization.

#3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet.

#4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin.

#5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody.

#6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies.

#7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament.

#8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin.

#9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
  3. Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
  4. Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).

Comments

5 Comments

  1. excellent! I learned a lot

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 12, 2011 - 5:38 PM
  2. Very detailed and helpful !!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 9:54 AM
  3. it is the first time I saw the image of nerves and vessels so lively. it is a GREAT model to study the dynamic development during mouse embryonic stage even in adult mouse! it is amazing that you found this technic!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 8, 2012 - 11:26 AM
  4. Thanks for the very useful method!
    Have you tried adult mouse skin? What would you recommend to modify if I do whole mount staining of adult mouse skin?
    Thanks a lot!

    Reply
    Posted by: Dong W.
    February 6, 2013 - 10:36 PM
  5. Yes, this method works on adult mouse skin as well. The detailed protocols are descibed in our revision paper submitting to Developmental Dynamics. Thanks!

    Reply
    Posted by: wenling l.
    February 7, 2013 - 2:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics