Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Neuroscience
 

Summary

Nós demonstramos a aplicação do indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais para determinar a alterações relativas na intensidade de fluorescência TMRM antes e após a aplicação de um estímulo específico. Mostramos também a aplicação da sonda de fluorescência H

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Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (51), e2704, doi:10.3791/2704 (2011).

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Abstract

Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) é fundamental para manter a função fisiológica da cadeia respiratória para gerar ATP. A perda significativa de células ΔΨm torna esgotado de energia, com posterior morte. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, mas a sua acumulação em condições patológicas leva ao estresse oxidativo. As duas principais fontes de ROS nas células são toxinas ambientais e do processo de fosforilação oxidativa. Disfunção mitocondrial eo estresse oxidativo têm sido implicados na fisiopatologia de muitas doenças e, portanto, a capacidade de determinar ΔΨm e ROS pode fornecer pistas importantes sobre o estado fisiológico da célula ea função das mitocôndrias.

Várias sondas fluorescentes (Rodamina 123, TMRM, TMRE, JC-1) pode ser usado para determinar Δψm em uma variedade de tipos celulares, e muitos indicadores de fluorescência (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) pode ser usado para determinar ROS . Quase todas as sondas de fluorescência disponíveis utilizados para avaliar ΔΨm ou ROS são um único comprimento de onda de indicadores, que aumentar ou diminuir sua intensidade de fluorescência proporcional a um estímulo que aumenta ou diminui os níveis de ΔΨm ou ROS. Assim, é imperativo para medir a intensidade de fluorescência destas sondas ao nível basal e após a aplicação de um estímulo específico. Isto permite uma para determinar a porcentagem de mudança na intensidade de fluorescência entre o nível de referência e um estímulo. Esta mudança na intensidade da fluorescência reflete a mudança nos níveis relativos de ΔΨm ou ROS. Neste vídeo, demonstramos como aplicar o indicador de fluorescência, TMRM, em neurônios corticais de ratos para determinar a variação percentual na intensidade de fluorescência TMRM entre o nível de base e após a aplicação de FCCP, um desacoplador mitocondrial. Os níveis mais baixos de TMRM fluorescência resultante do tratamento FCCP refletem a despolarização do potencial de membrana mitocondrial. Também mostramos como aplicar a fluorescência da sonda H 2-DA DCF para avaliar o nível de ROS em neurônios corticais, primeiro na linha de base e, em seguida, após a aplicação de H 2 O 2. Este protocolo (com pequenas modificações) também podem ser usados ​​para determinar mudanças no ΔΨm e ROS em diferentes tipos celulares e em neurônios isolados de outras regiões do cérebro.

Protocol

1. Cultura de células

  1. Neurônios corticais estão isolados e cultivados com técnicas previamente descritas e semeadas em placas de cultura com um fundo de vidro (Mattek Corporation, Ashland, MA) revestidas com poli-D-lisina e laminina 1.

2. Preparação das soluções estoque para o fluorescente sondas TMRM e 2 H DCF-DA

  1. Prepare uma solução estoque de 10 mM de TMRM pela dissolução de 5,0 mg de TMRM em 1 ml de dimetilsulfóxido anidro. Vortex por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de um mês.
  2. Em seguida, preparar uma solução estoque de 10 mM de H 2 DCF-DA dissolvendo 4,87 mg de H 2 DCF-DA em 1 ml de DMSO anidro. Da mesma forma vortex, por 1 min. Então, faça alíquotas e armazená-los a -20 ° C, proteger da luz, e usar dentro de uma semana.

3. Carregando neurônios de rato cortical com TMRM e 2 H DCF-DA

TMRM é um potenciométrica, indicador de célula-permeável fluorescentes que se acumula no interior altamente carregadas negativamente das mitocôndrias. É importante usar a baixas concentrações (10-50 nm) de TMRM para evitar a auto-extinção da TMRM mitocondrial. Então, o sinal de fluorescência de TMRM pode ser diretamente co-relacionados com a ΔΨm através da membrana mitocondrial interna. A perda de ΔΨm causas TMRM a fuga de mitocôndrias, resultando em uma perda de intensidade de fluorescência. H 2 DCF-DA é a célula-permeável sonda convertido em DCF-DA por esterases intracelulares, e os resultados a sua oxidação no DCF fluorescente. A concentração final de H 2 DCF-DA varia entre 2-10 mM e deve ser testado empiricamente em neurônios derivados de diferentes regiões do cérebro vez que a concentração de carga elevada pode resultar na saturação de fluorescência DCF, mesmo na ausência de H 2 O 2. A presença de qualquer oxidante endógeno ou exógeno (por exemplo, óxido nítrico, peróxido de hidrogênio) aumentará DFC intensidade de fluorescência. Abaixo, fornecemos um protocolo para o carregamento com neurônios de rato cortical TMRM e 2 H DCF-DA.

  1. Para carregar os neurônios de rato cortical com TMRM, primeiro, lave os neurônios cultivados 3 vezes com tampão Tyrode do (Overlay Texto: TB: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 10 HEPES mM; ajustar o pH para 7,4 com NaOH). Então, prepare 20 nM de TMRM diluindo a 10 mM de ações TMRM 1 / 1000 vezes em TB e depois adicionar 2 l da TMRM diluído por 1 ml de TB. Incubar os neurônios com TMRM por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, monte o prato de cultura no palco do microscópio e começar de imagem.
  2. Para carregar os neurônios de rato cortical com H 2 DCF-DA, lave os neurônios cultivados 3 vezes com TB. Em seguida, prepare 2 mM de H 2 DCF-DA diluindo a 10 mM H 2 DCF-DA estoque 10/01 vezes em TB e depois adicionar 2 l da diluição H 2 DCF-DA por 1 ml de TB. Então, incubar os neurônios com H 2 DCF-DA por 45 minutos no escuro à temperatura ambiente. Após 45 min, lave os neurônios 4 vezes com TB para remover indicador fluorescente excesso antes de obter imagens.

4. Ao vivo imagens de neurônios incubadas com TMRM para determinar ΔΨm

  1. Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com TMRM, microscopia confocal de varredura a laser (Overlay Texto: LSM 510, Carl Zeiss Inc.), com a aplicação do programa de séries temporais ao vivo, é usado. Aplicar de baixa resolução e atenuada a laser de potência (Overlay Texto: baixa resolução: 256 x 256; potência do laser: 1%) para minimizar o tempo necessário para obter imagens e evitar fotodegradação.
  2. . Em seguida, ajustar o foco dos neurônios montado carregado com TMRM usando luz refletida. Examine a fluorescência TMRM pela iluminação a 514 nm e detecção a 570 nm. Definir o ganho de detecção de uma câmera, logo abaixo do nível de saturação.
  3. Uma vez que todos os parâmetros que incluem resolução, potência do laser, o ganho de detecção de uma câmera, e lapso de tempo de intervalo para obter imagens são definidas, não alterar essas configurações entre experimentos. Em seguida, altere o campo. Começar a recolher imagens.
  4. Para testar as alterações no ΔΨm, estímulos como uma mM de FCCP ou 2 mg / ml de oligomicina, pode ser aplicado, de forma significativa ou despolarizar hiperpolarizar o potencial de membrana mitocondrial, respectivamente. Estas alterações serão refletidas por uma diminuição na intensidade de fluorescência TMRM comparada com a intensidade de fluorescência de base, no caso de FCCP, ou um aumento na intensidade de fluorescência TMRM no caso de oligomicina.

5. Imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA para determinar ROS

  1. Para realizar imagens ao vivo de neurônios incubadas com H 2 DCF-DA, primeiro, montar a placa de cultura no palco de um microscópio. Ajustar o foco das células-nosing luz refletida. Examine DCF fluorescência por excitação a 488 nm e emissão a 515 nm.
  2. Em seguida, ajuste a potência do laser para 5-7%, o ganho do detector, e resolução de 256 x 256. Não altere estas configurações entre experimentos. Em seguida, defina a freqüência para a obtenção de imagens ao vivo usando o programa de séries temporais.
  3. Selecione um campo novo e começar a adquirir as imagens. Para detectar mudanças nos níveis de ROS, tratar células com 100-200 mM de H 2 O 2. Isso será refletido por um aumento na intensidade de fluorescência DCF em comparação com o nível basal.

6. Análise de dados

  1. Use região de interesse (Overlay Texto: ROI) ferramenta do programa de LSM para selecionar as áreas. Então, medir o TMRM ou ROS intensidades de fluorescência. Selecione ROIs de regiões mitocondriais ou ROIs do corpo celular em células de toda fotografada para medir a intensidade de fluorescência de TMRM ou ROS, respectivamente.
  2. Calcular a intensidade média de fluorescência de todos os ROIs de cada célula para TMRM ou de corpos de células inteiras para todas as células com imagens de ROS para cada ponto de tempo. Selecione regiões próximas às células para calcular a intensidade de fluorescência de fundo. Tomar várias medidas e calcular a intensidade média de fundo.
  3. Subtrair a intensidade de fluorescência média de fundo de média intensidades de fluorescência das ROIs em cada célula para cada ponto de tempo usando o Microsoft Excel. Depois de subtrair a intensidade de fundo, normalizar a intensidade TMRM ou DCF fluorescência para a fluorescência de base usando esta fórmula (Overlay Texto: ΔF = FF o / F o x 100, onde F = intensidade de fluorescência em qualquer ponto do tempo, Para = linha de base de fluorescência). Então, use o programa Sigma Plot para gerar o gráfico mostrando as mudanças na intensidade de fluorescência ao longo do tempo.

7. Resultados representante

Figura 1A mostra uma imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato incubadas com TMRM. Adição de FCCP, um desacoplador mitocondrial, leva a despolarização mitocondrial e uma perda de TMRM intensidade de fluorescência (Figura 1B). A linha de base nível de fluorescência TMRM permanece estável antes da adição de FCCP (o primeiro 350 seg;. Fig 1C). Análise quantitativa de fluorescência TMRM mudanças ao longo do tempo mostra uma diminuição significativa na fluorescência TMRM após a adição de FCCP (Fig. 1C).

Figura 1D mostra a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com DCF. Adição de H 2 O 2 resulta em aumento da intensidade de fluorescência DCF nos corpos celulares (Fig. 1E). A linha de base DCF nível de fluorescência mantém-se inalterado (os primeiros 120 segundos) antes da aplicação de H 2 O 2. Lapso de tempo de medições de fluorescência DCF mostram seus níveis estáveis, o que aumenta depois de H 2 O 2 de tratamento (Fig. 1F).

Figura 1
Figura 1. Avaliação do potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ROS em neurônios corticais rato vivo. (A) Representante imagem de fluorescência de neurônios corticais carregado com TMRM. Após a digitalização da linha de base TMRM de fluorescência, os neurônios foram tratados com o FCCP protonophore (1 mM). Para a direita é um bar pseudo intensidade de fluorescência TMRM com o máximo de amarelo e preto brilhante representação e intensidade mínima, respectivamente. A perda de fluorescência TMRM das regiões mitocondrial indica o colapso do ΔΨm sobre FCCP tratamento (painel B). A representação quantitativa da mudança na intensidade de fluorescência TMRM em momentos diferentes, antes e após o tratamento FCCP é mostrado no painel C. (D) a imagem de fluorescência de neurônios corticais de rato carregado com H2DCF-DA. Após a determinação da linha de base DCF fluorescência, as células foram tratadas com 200 mM H 2 O 2, ea mudança no DCF fluorescência foi avaliada. Um aumento na fluorescência do DCF reflete o aumento nos níveis de ROS em H 2 O 2 tratamento (E). Análise quantitativa das mudanças no DCF fluorescência, antes e depois do H 2 O 2 tratamento, é mostrado no painel da barra de escala F. = 10 mM

Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Ao vivo imagens de células de TMRM em neurônios corticais antes e depois disso FCCP utilizando objetiva de 40X. A intensidade mostra um pseudo (amarelo brilhante, antes da adição FCCP) e diminuição máxima (cor vermelha, após a adição FCCP) TMRM intensidade de fluorescência após a adição FCCP. Clique aqui para ver o vídeo

Vídeo. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Ao vivo imagens de células de DCF nos neurônios corticais antes e depois do H 2 O 2 disso utilizando objetiva de 40X. A linha de base DCF fluorescência tem cor verde-claro nos corpos celulares e H2O2 disso aumenta o DCF intensidade de fluorescência de cor verde brilhante. Clique aqui para ver o vídeo

Discussion

Nós apresentamos um procedimento passo-a-passo descreve como determinar ΔΨm e ROS em neurônios corticais de rato usando o fluorescente indicadores TMRM e H 2 DCF-DA, respectivamente. Para outros tipos de células, é importante determinar empiricamente a concentração final e tempo de carregamento para TMRM ou 2 H DCF-DA. Em geral, as concentrações de gama TMRM 2-20 nM, eo tempo de incubação das células com TMRM varia de 20 a 60 min. A concentração final de H 2 DCF-DA faixas de 2-10 mM, e incubação de células em uma solução de carga contendo este indicador varia de 30-45 min.

É importante para otimizar a potência do laser e velocidade de digitalização de levar as imagens para evitar a foto-toxicidade para as células e as mudanças na intensidade de fluorescência (por exemplo cintilação de TMRM fluorescência), na ausência de qualquer estímulo. As configurações otimizadas óptico deve resultar em um sinal de fluorescência que não está acima ou abaixo saturadas (threshold) na ausência de estímulo. As condições ideais para coletar as imagens de um campo selecionado em uma potência do laser em particular e uma velocidade de digitalização são obtidas quando não há mudanças na intensidade de fluorescência da sonda na ausência de qualquer estímulo por 10-15 min de imagens ao vivo.

Outras sondas de fluorescência para determinar ΔΨm incluem rodamina 123 e tetra metil etil éster rodamina (TMRE). No entanto, eles foram encontrados para inibir os processos respiratórios em dois mitocôndrias isoladas. Importante, TMRM não tem nenhum efeito sobre a respiração mitocondrial em baixas concentrações 2 e tem fototoxicidade baixa e fotobranqueamento 3, em comparação com outras sondas. H 2 DCF-DA é um bom indicador para ROS como é bem retida nas células e reconhece as espécies oxidantes diversos, tais como peróxidos, óxidos de super, e óxido nítrico 4.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (K22NS050137 a JCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass bottom culture dish MatTek Corp. P35G-1.5-14-C
NbActive4 BrainBits NbActive4
TMRM Invitrogen T668
H2DCF-DA Invitrogen C400
NaCl Sigma-Aldrich S6191
KCl Sigma-Aldrich P3911
CaCl2∙2H2O Sigma-Aldrich C3306
MgCl2∙6H2O Sigma-Aldrich M2670
D-Glucose Sigma-Aldrich G6152
HEPES Invitrogen 15630

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References

  1. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. (2007).
  2. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
  3. Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
  4. Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).

Comments

15 Comments

  1. I have ² queries:

    1. U ddid not mention washing off of the TMRM containing media before imaging. DŒs that mean that there is TMRM present in the imaging media?

    ². If DCFDA is washed off and imaging being done, upon addition of H²O², how can the DCF fluorescence increase?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 25, 2012 - 3:02 AM
  2. 1. We did not wash the neurons after TMRM loading. TMRM makes equilibrium between compartments (mitochondria-cytosol- extracellular buffer) in response to negative membrane potentials and a very low concentration of the dye has to be present in the imaging buffer throughout the experiment.
    ². The principle of H²DCF-DA is different as it is cell-permeable probe and trapped into the cytosol once the acetate group is cleaved by intracellular esterases. The access of dye from extracellular medium has to be washed out. Intracellular oxidation of DCF-DA by reactive oxygen species (generated by H²O² addition) results an increased DCF fluorescence.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 26, 2012 - 12:42 AM
  3. Thanks for the response. However regarding DCFDA, if the dye is washed off, and then H²O² added to increase the ROS inside cells, where is the dye to react with the newly formed ROS? How will the fluorescence increase if there are no more molecules of DCF available for reaction?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 29, 2012 - 9:42 AM
  4. When we incubate cells with H²DCFDA for an optimal time period, most of the dye molecules are trapped in cytosol and excess of dye has to be washed from extracellular buffer. The cytosolic dye will have enough molecules to produce many fold increase of fluorescence upon oxidation. Due to basal ROS activity some of the dye molecule gets oxidized but not all until cells undergo some stress which causes ROS formation. It is well known that H²O² addition to the cells result intracellular ROS formation and even H²O² itself can diffuse through the cell membrane and oxidize the cytosolic dye to increase the fluorescence.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 3, 2012 - 12:43 AM
  5. Changes in plasma membrane potential will also lead to a decrease in both the mitochondrial and cytosolic TMRM signals, (because there is a step-wise concentration gradient mitochondrial > cytosol > medium). How do you think is the best way distinguish between a loss of signal due to mitochondrial depolarization vs. loss of signal due to plasma membrane depolarization?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 5, 2012 - 9:28 PM
  6. A previous lab member has used KCl in the media to keep the plasma membrane potential constant so that changes in TMRM fluorescence are reflective of changes in mitochondrial potential only rather than a combination of both.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 7, 2012 - 1:57 AM
  7. In non- quenched method (1 to 50nM, should be optimized for a particular cell type) majority of the TMRM fluorescence arise from mitochondria and any change in TMRM fluorescence (either single mitochondrion or entire cell) can be directly correlated to polarized state of mitochondria. Alternately the ratio of TMRM fluorescence from mitochondrial and non-mitochondrial regions in cell can be normalized to ratio of TMRM fluorescence at baseline and after FCCP addition. A parallel control experiment to monitor the TMRM fluorescence under plasma membrane depolarization (such as in presence of 30mM KCl) also can be performed.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 7, 2012 - 12:50 PM
  8. For the DCFDA experiments, is the use of verapamil advisable to inhibit the efflux of DCF from cells?

    Can both TMRM and DCFDA be used at the same time or will one affect the read-out of the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 9, 2012 - 2:31 AM
  9. We never tried using verapamil in our experiments but there are reports using this drug in DCFDA experiments.
    Yes TMRM and DCFDA can be used at the same time to monitor ROS formation and mitochondrial membrane potential.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    March 11, 2012 - 1:30 AM
  10. Hi, I am curious how stable the preparation is in order to measure membrane potential. We have a 4 h protocol applied to cells in culture and at the end of this treatment we'd like to assess the membrane potential. Would you recommend loading TMRM before or after the 4 h procedure? I am afraid the membrane potential might change during the 45 min incubation. Therefore, it seems better to load TMRM before perhaps.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 16, 2012 - 11:37 PM
  11. TMRM incubation time varies from one cell type to another. However, once the equilibrium is reached, TMRM fluorescence remains quite stable for long time. You can try loading TMRM before treatment and keep a parallel control loading without any treatment to rule out the change in TMRM fluorescence due to artifacts.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 17, 2012 - 11:54 PM
  12. Thanks. Another question is whether you can easily convert the fluoresce intensity ratio to absolute membrane voltage.

    Reply
    Posted by: Bela S.
    July 24, 2012 - 2:22 PM
  13. We can not convert the TMRM fluorescence into absolute membrane voltage. The difference in TMRM fluorescence intensity is always a relative change between the experimental groups.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    July 24, 2012 - 11:13 PM
  14. But I still have some queries . In your article only described the determination of mitochondrial membrane potential and oxygen species in primary cortical neurons, my query is if I want to know the relationship of my target drug and its concentration to the result , how should I go on my study? Which step should I give my compound to the cell? How can I determine the appropriate concentration? I really appreciate you can give me some advice. I am looking forward for your reply. Wish you have a nice day. Many thinks~

    Reply
    Posted by: longjun z.
    February 25, 2013 - 9:40 PM
  15. First, you will have to optimize the dye as well as the drug concentration in the cells independently. I would suggest optimizing the dye loading conditions first, then do dose dependent changes in the fluorescence of either TMRM or DCF to get an optimal drug concentration to start with. Once you have the optimized conditions, you can measure the ROS and membrane potential in two ways. 1. Incubate the cells with the probe; image them before and after the addition of drug. ². You can incubate the cells with drug and then load the cells with probe to monitor the effect of your drug. If longer incubation of drug is required, second method is preferred. Both the methods are well documented in the literature.

    Reply
    Posted by: Dinesh J.
    February 28, 2013 - 1:23 PM

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