في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

Medicine
 

Summary

توضح هذه المقالة

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rahim, S., Üren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792, doi:10.3791/2792 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نشر المنتشر من الخلايا الخبيثة يتطلب تدهور الغشاء القاعدي، المرفقات من خلايا الورم لبطانة الأوعية الدموية، تراجع من التقاطعات البطانية وأخيرا الغزو والهجرة من الخلايا السرطانية من خلال طبقة البطانية لدخول مجرى الدم كوسيلة من وسائل النقل إلى مواقع بعيدة في البلد المضيف 1-3. مرة واحدة في نظام الدورة الدموية، وسرطان الخلايا الشعرية التمسك الجدران ويتسرب إلى الأنسجة المحيطة بها لتشكيل أورام النقيلي 4،5. يمكن تكرارها مختلف مكونات الورم التفاعل خلية خلية البطاني في المختبر من خلال تحدي أحادي الطبقة من الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVEC) مع الخلايا السرطانية. وتشير الدراسات التي أجريت مع الإلكترون المجهري وعلى النقيض من المرحلة أن في تسلسل المختبر من الأحداث تمثل إلى حد ما في الجسم الحي عملية النقيلي 6. هنا، نحن تصف تقنية الكهربائية مقاومة على أساس ان ترصد والكمي في الوقت الحقيقي invasأيون الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم الخبيث.

Giaever وفندق Keese وصف لأول مرة تقنية لقياس التقلبات في مقاومة عندما ينمو عدد السكان من الخلايا على سطح الأقطاب 7،8. الصك xCELLigence، المصنعة من قبل شركة روش، ويستخدم تقنية مماثلة لقياس التغيرات في مقاومة الكهربائية والخلايا نعلق وتنتشر في طبق الثقافة مغطاة مجموعة مسرى مكروي الذهب الذي يغطي حوالي 80٪ من المساحة في أسفل البئر. كما خلايا نعلق وتنتشر على سطح القطب، فإنه يؤدي إلى زيادة في مقاومة الكهربائية 9-12. يتم عرض مقاومة كمعلمة يسمى خلية مؤشر أبعاد، وهو يتناسب طرديا مع مساحة إجمالية قدرها الأنسجة الثقافة جيدا أن تغطيها الخلايا. وبالتالي، فإن مؤشر الخلية يمكن أن تستخدم لرصد التصاق الخلية، ونشر، مورفولوجيا وكثافة الخلايا.

ويستند مقايسة غزو الموضحة في هذه المقالة على التغييراتفي مقاومة الكهربائية في القطب / الخلية الطور البيني، كما يبلغ عدد سكانها غزو الخلايا الخبيثة من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 1). تعطيل تقاطعات البطانية، تراجع من أحادي الطبقة البطانية واستبدال من قبل الخلايا السرطانية يؤدي إلى تغيرات كبيرة في مقاومة. هذه التغييرات ترتبط مباشرة مع القدرة الغازية من الخلايا السرطانية، أي غزو من قبل خلايا شديدة العدوانية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مقاومة الخلية والعكس بالعكس. توفر هذه التقنية ميزة اثنين أضعاف خلال الأساليب القائمة لقياس الغزو، مثل غرفة بويدن والمقايسات matrigel: 1) البطانية التفاعل خلية خلية للورم يحاكي بشكل وثيق في عملية الجسم الحي، و 2) يتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي، الوقت وأكثر قابلة للقياس بسهولة، خلافا لتحليل نقطة النهاية بالنسبة لطرق أخرى.

Protocol

1. إعداد

  1. يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود.
  2. يتم وضع محطة xCELLigence في الحاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
  3. استخدام الخلايا HUVEC مرور منخفض، ويفضل أن لا يزيد عن مرور 6. أيضا، تأكد من أن الخلايا ليست أكثر من 75٪ متموجة في وقت الحصاد.
  4. تزرع الخلايا HUVEC في EGM-2 وسائل الإعلام تشكيل مع عدة EGM-2 رصاصة (ونزا العلوم البيولوجية) التي تحتوي على عوامل النمو، وملاحق و 5٪ مصل بقري جنيني.
  5. يجب إزالة كل آثار التربسين من الايقاف الخلية بواسطة الخلايا في 200xg الغزل، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإعادة التعليق عليها لكثافة الخلية المشار إليها.
  6. معطف xCELLigence E-لوحة 16 مع 0.1٪ الجيلاتين لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100μL المعاد EGM-2 وسائل الإعلام. إجراء قراءة فارغة على نظام xCELLigence لقياس الخلفيةمقاومة في غياب الخلايا.

2. توليد HUVEC أحادي الطبقة

  1. حصاد قارورة شبه متموجة من الخلايا HUVEC من قبل trypsinization. Resuspend الخلايا في المعاد EGM-2 وسائط إلى كثافة النهائي من 2.5 × 10 5 خلية / مل.
  2. إلى كل بئر من خلفية معايرة E-لوحة تحتوي على 100μL EGM-2 وسائل الإعلام، إضافة 100μL من تعليق الخلية HUVEC (2.5 × 10 4 خلايا HUVEC).
  3. تثبيت فورا E-بلايت في الصك xCELLigence.
  4. برنامج xCELLigence برنامج لأداء قراءات مقاومة في 10 دقائق.
  5. السماح للخلايا البطانية تنمو لمدة 18-21 ساعة حتى تشكيل أحادي الطبقة، كما يتضح من تسطيح مؤشر الخلية (الشكل 2).

3. بالإضافة إلى ذلك بغزو الخلايا وتطبيع البيانات.

  1. مرة واحدة وقد شكلت HUVEC أحادي الطبقة مستقرة، والخلايا السرطانية عن طريق الحصاد trypsinization و resuspend إلى أوكار النهائيإيتي من 1 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام المستخدمة لزراعة الخلايا السرطانية (مثل RPMI أو وسائل الإعلام التي تحتوي على DMEM FBS 10٪)
  2. قراءات مقاومة قفة على البرنامج xCELLigence وإزالة E-لوحة من المحطة.
  3. إزالة EGM-2 وسائل الإعلام بواسطة الشفط. إضافة 100μL من التعليق الخلية السرطانية التي تحتوي على 1 × 10 4 خلايا. عموما، وهي نسبة 1:2.5 الخلايا السرطانية: الخلايا البطانية المصنف، يعمل على نحو أفضل للمقايسة. ومع ذلك، فإن النسبة يمكن أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية.
  4. وضع لوحة E على نظام xCELLigence في الحاضنة ومواصلة مقاومة قراءات في 10 دقائق.
  5. يمكن رصد الغزو في الوقت الحقيقي خلال الساعات القادمة 6-12 بأنه انخفاض في مؤشر الخلية بسبب تراجع من التقاطعات البطانية والاختراق عن طريق غزو الخلايا السرطانية.
  6. تطبيع النتائج إلى وقت بالإضافة إلى ذلك بغزو الخلايا السرطانية. البرنامج xCELLigence تصاريح التطبيع إلى أي نقطة زمنية والنتائجويمكن الاطلاع مباشرة في إطار البرنامج.

4. ممثل النتائج:

ويرد مثال لغزو أحادي الطبقة HUVEC من قبل خلايا المنتشر وغير المنتشر في الشكل 3. K7M2 هو خط خلية عظمية النقيلي. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من هيكل الخلية رابط ezrin البروتين، والتي تمثل خصائص الغازية من هذا الخط الخلية 13،14. عندما يتم الطعن HUVEC الخلايا مع خلايا K7M2، أن هناك انخفاضا في المقاومة الكهربائية في غضون 6 ساعات. هذا الانخفاض في المقاومة الكهربائية يمثل غزو أحادي الطبقة HUVEC من قبل خلايا الورم الغازية. الخلية خط K12، من ناحية أخرى، ويعرب عن مستويات أقل بكثير من ezrin وبالتالي هو أقل النقيلي 13. تحدي أحادي الطبقة HUVEC مع K12 الخلايا يؤدي إلى انخفاض حاد في أقل قدر من المقاومة لهذه الخلايا غير قادرة على الانضمام إلى غزو أو من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 3).

الشكل 1. رسم تخطيطي للعملية تدفق العمل لغزو الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم. ومطلي الخلايا HUVEC على الجيلاتين المغلفة لوحات E وسمح لتشكيل أحادي الطبقة متموجة. تضاف الخلايا الخبيثة بمجرد تشكيل أحادي الطبقة ويتم رصد الغزو في الوقت الحقيقي كما يغير مؤشر الخلية بسبب غزو أحادي الطبقة البطانية.

الشكل 2
الشكل 2. تشكيل أحادي الطبقة HUVEC. التغييرات في مؤشر الخلية كخلايا HUVEC نعلق على وتنتشر على أقطاب الذهب الجيلاتين المغلفة. ويمثل تشكيل أحادي الطبقة متموجة من استقرار مؤشر الخلية بعد 18 ساعة.

الشكل (3)
الشكل (3). غزو ​​الخلايا HUVEC من قبل K7M2 وK12 خلايا عظمية. وحدث انخفاض حاد في سليحدث L-مؤشر في غضون ساعات قليلة لإدخال الخلايا K7M2 النقيلي للغاية. K12 الخلايا، من ناحية أخرى، هي أقل النقيلي وغير قادرين على اختراق أحادي الطبقة البطانية بكفاءة كما K7M2 الخلايا. ويمثل هذا انخفاضا أقل من قبل حاد في مؤشر الخلية عندما يتم الطعن في أحادي الطبقة HUVEC مع K12 الخلايا. مراقبة يمثل مقاومة من أحادي الطبقة HUVEC في غياب الخلايا السرطانية. وقد أجريت تجارب في ثلاث نسخ.

Discussion

في الوقت الحقيقي HUVEC مقايسة الغزو هو طريقة بسيطة، لكنها قوية لغزو الرصد. أنها توفر النتائج في الوقت الحقيقي، والذي هو تفوقا كبيرا على التقنيات التقليدية الأخرى التي تعتمد على تحليل نقطة النهاية. الفحص يمكن تعديلها لاختبار المخدرات، والأجسام المضادة، والبروتينات يغاندس باسم مثبطات أو التحفيز والتشجيع من ورم خبيث. تأثير عوامل مختلفة على البطانية / سرطان الخلية عبر الحديث يمكن تقييمها كذلك. عند إدخال عوامل خارجية، مثل عوامل النمو والمخدرات في وسائل الإعلام والثقافة، فمن المهم للتأكد من أنها لا تؤثر على سلامة أحادي الطبقة HUVEC. اضطراب أحادي الطبقة HUVEC يمكن اختبارها من خلال إدخال وكيل الخارجية في غياب غزو الخلايا، وضمان أنه لا يوجد أي تغيير في مؤشر الخلية. وبالتالي، ينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة كجزء من التصميم التجريبي.

خطوط مختلفة من الخلايا تظهر منحنيات مختلفة الخلية مؤشر لأنها تشكل أسيوطأحادي الطبقة luent. شكل منحنى، وكذلك الحد الأقصى خلية مؤشر تحقيقه، هو من نوع خلية معينة. الخلايا HUVEC تظهر عابرة مميزة تسطيح مؤشر الخلية بعد 4-6 ساعات البذر، تليها استقرار آخر في مؤشر الخلية أعلى بعد 16-18 ساعة. وبالتالي، فإنه من المهم للسماح للخلايا تشكيل أحادي الطبقة متموجة لمدة 18 ساعة على الأقل قبل إضافة الخلايا السرطانية.

منذ مؤشر الخلية يعتمد على البيئة الأيونية في القطب / الخلية الطور البيني، والعوامل المختلفة مثل خلية التشكل ونوعية التصاقات خلية خلية التأثير على مؤشر الخلية، بالإضافة إلى منطقة أسفل جيدا تغطيتها. وبالتالي، فإن الانخفاض في مؤشر الخلية، والذي يحدث عند غزو الخلايا السرطانية، هي وظيفة من عدة عوامل، والتي تشمل تراجع من التقاطعات البطانية وغزو الخلايا السرطانية لاحقة.

يتم تصنيعها الصك xCELLigence في ثلاثة أشكال مختلفة: ريال مدريد محلل خلية الوقت(RTCA) ليرة سورية، RTCA النائب RTCA وموانئ دبي. وRTCA SP صك يحمل واحدة 96-جيدا لوحة E حين أن الصك النائب RTCA يمكن أن تعقد ما يصل إلى ستة 96 جيدا لوحات E في وقت واحد. وهذا يسمح لفحص عالية الإنتاجية من الأدوية والمركبات. يتم تنفيذ التجارب في هذا المقال باستخدام أداة موانئ دبي RTCA، التي يمكن أن تعقد ثلاث 16 جيدا لوحات E. كل محطة عقد E-لوحة يمكن أن تعمل بشكل مستقل، والذي يسمح للمستخدمين متعددة لتشغيل التجارب في وقت واحد. ويمكن أيضا الصك موانئ دبي RTCA أن تستخدم لدراسة الهجرة باستخدام CIM لوحات. هذه هي لوحات 16 بشكل جيد مع الغرف العلوية والسفلية مفصولة البولي إثيلين (PET) الغشاء مع حجم المسام وسيطة من 8um. توجد أجهزة استشعار إلكترونية على الجانب السفلي للغشاء يسهل اختراقها للغرفة العليا. مجلس النواب بمثابة خزان للجاذب كيميائي للخلايا في مجلس الشيوخ. ومع ذلك، فإن الميزة الرئيسية للمقايسة غزو HUVEC خلال لوحات CIM هو أن غزو الخلايا السرطانية في السابق أناليست مقيدة حجم المسام، كما غزو الخلايا البطانية يعتمد على عبر الحديث بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية.

ويمكن أيضا فحص غزو HUVEC سيتم تنفيذه على صك Z ECIS، المصنعة من قبل الفيزياء الحيوية التطبيقية (تروي، نيويورك). الصك Z ECIS تستخدم تقنية مماثلة في الصك xCELLigence، مع وجود اختلافات في تكوينات مجموعة والقطب. لقد أجرينا بنجاح فحوصات غزو HUVEC باستخدام صفائف ECIS 8 جيد. ومن المهم أن نلاحظ أن مساحة السطح جيدا أسفل أكبر في صفائف ECIS، الأمر الذي يتطلب عددا أكبر من الخلايا البطانية والورم ليكون مطلي: 2.5 × 10 5 و 1 × 10 5 خلايا على التوالي.

Disclosures

وقدمت تكلفة النشر لهذه المخطوطة التكرم من قبل شركة روش العلوم التطبيقية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل بسخاء من أموال من أطفال مؤسسة السرطان (بالتيمور، MD)، براندون لي كارينغتون مؤسسة (سيلفر سبرينغ، MD)، وزارة الدفاع (W81XWH-10-1-0137) والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA108641).

ونود أن نشكر الدكتور انطون Wellstein وأعضاء مختبره لتبادل خبراتهم ومساعدتنا على تحسين الأساليب المعروضة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
xCELLigence RTCA DP station Roche Group 05469759001
RTCA control unit Roche Group 05454417001 Notebook with preinstalled RTCA software
E-Plate 16 Roche Group 05469830001
HUVEC cells Lonza Inc. CC-2517
EGM-2 media Lonza Inc. CC-3156
EGM-2 bullet kit Lonza Inc. CC-4176
0.1% Gelatin in sterile H2O EMD Millipore MCPROTO045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
  2. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
  3. Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
  4. Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
  5. Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
  6. Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
  7. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  9. Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
  10. Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
  11. Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
  12. Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
  13. Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics