암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

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Rahim, S., Üren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792, doi:10.3791/2792 (2011).

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Abstract

악성 세포의 전이성 확산은 호스트에서 먼 사이트에 교통 수단으로 혈류를 입력 할 내피 층을 지하 막, 혈관 내피 세포에 종양 세포의 부착, 혈관 접합의 철회 및 종양 세포의 마지막 침략과 이동의 저하를 필요로 1-3. 일단 순환 시스템, 암 세포 벽을 모세와 전이성 종양 4,5 형성하는 주변 조직에 extravasate을 준수합니다. 종양 세포 - 내피 세포 상호 작용의 다양한 구성 요소는 암 세포와 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 단층에 도전하여 체외에서 복제 할 수 있습니다. 전자 및 위상 대비 현미경으로 수행 연구의 이벤트 체외 순서에서 상당히 생체 전이성 과정 6을 대표하는 것이 좋습니다. 여기, 우리는 모니터링 및 실시간 invas의 정량화 전기 임피던스 기반 기술을 설명악성 종양 세포에 의해 내피 세포의 이온.

Giaever 및 Keese 먼저 세포의 인구는 전극 7,8의 표면에서 자랄 때 임피던스의 변동을 측정하는 방법을 설명합니다. 로슈에 의해 제조 xCELLigence 악기, 세포가 잘 하단에있는 면적의 약 80 %를 커버 골드 미세 전극 배열로 덮여 문화 접시에 부착 확산으로 전기 임피던스 변화를 측정하기 위해 유사한 기술을 사용합니다. 세포 부착 및 전극 표면에 확산으로, 그것은 9-12 전기 임피던스의 증가로 연결됩니다. 임피던스는 세포에 의해 덮여 잘 조직 문화의 총 면적에 비례 차원 매개 변수 되나 세포 인덱스로 표시됩니다. 따라서, 세포 지수는 세포 부착, 확산, 형태학 및 세포 밀도를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

이 문서에서 설명 침공 분석은 변화에 근거전극 / 세포 계면에서의 전기 임피던스, 악성 세포의 인구로 HUVEC 단층 (그림 1)를 통해 침입. 내피 분기점의 장애, 종양 세포에 의해 내피 세포의 단층 및 교체의 철회는 임피던스 큰 변화로 이어집니다. 이러한 변화는 직접적으로 종양 세포의 침입 용량 상관 관계, 즉, 매우 공격적인 세포에 의해 침략 세포 임피던스와 그 반대의 큰 변화로 이어집니다. 내피 세포 종양 세포의 상호 작용이 더 밀접하게 생체 과정에서 모방, 2) 데이터의 실시간 얻을 수있다 : 1)이 기술은 보이든 챔버와 마트 리젤의 분석으로 침략을 측정하는 기존의 방법에 비해 두 가지 이점을 제공합니다 시간과 같은 다른 방법에 대한 엔드 포인트 분석이 아닌, 더 쉽게 정량화 할 수있다.

Protocol

1. 준비하기

  1. 모든 단계는 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다.
  2. xCELLigence 역은 5 % CO 2의 존재에 37 ° C 배양기에 배치됩니다.
  3. 통로 6보다 바람직하게 낮은 통로 HUVEC 세포를 사용합니다. 또한, 세포가 더 이상 수확의 시간에 합류 % 75 이상 없는지 확인합니다.
  4. HUVEC 세포는 성장 인자, 보충 교재 및 5 % 태아 소 혈청을 포함하는 EGM-2 총알 키트 (Lonza의 생물 과학)를 재구성 EGM - 2 미디어에서 재배된다.
  5. 트립신의 모든 흔적은 200xg에서 세포를 회전 PBS로 한번 세척 및 표시 셀 밀도에게 현탁하여 세포 현탁액에서 제거해야합니다.
  6. 37에서 1 시간 동안 젤라틴 0.1 %로 코트 xCELLigence E-플레이트 16 ° C 또는 하룻​​밤에 ° C. PBS로 접시를 씻고 100μL 재구성 EGM - 2 미디어를 추가 할 수 있습니다. 배경을 측정하는 xCELLigence 시스템에 빈 읽기를 수행세포의 부재 임피던스.

2. HUVEC 단층 생성

  1. 트립신에 의한 HUVEC 세포의 하위 합류 플라스크를 수확. 2.5 X 10 5 세포 / ML의 최종 농도로 재구성 EGM - 2 미디어 세포를 resuspend.
  2. 100μL EGM-2 미디어를 포함하는 E-플레이트 교정 배경의 각 웰에, HUVEC 세포 현탁액 (2.5 × 10 4 HUVEC 세포)의 100μL 추가 할 수 있습니다.
  3. 즉시 xCELLigence 악기의 E-플레이트를 설치합니다.
  4. 프로그램 xCELLigence 소프트웨어가 10 분 간격으로 임피던스 판독을 수행합니다.
  5. 그들은 단일 층을 형성 때까지 내피 세포로 (그림 2) 셀 인덱스의 병합에 의해 입증 18-21 시간 동안 성장하자.

3. 셀 및 데이터 정규화를 침입의 추가.

  1. 일단 안정 HUVEC 단층은 최종 굴을 트립신과를 Resuspend으로 수확 종양 세포가 형성1 X 10 5 세포 / 종양 세포 (예 : RPMI 또는 DMEM 매체 10 % FBS를 포함)을 성장하는 데 사용 미디어 ML의 ITY
  2. 일시 정지 임피던스 xCELLigence 소프트웨어를 판독하고 역에서 E-플레이트를 제거합니다.
  3. 흡인에 의해 EGM-2 용지를 제거합니다. 1 × 10 4 세포를 포함하는 종양 세포 현탁액의 100μL를 추가합니다. 일반적으로, 종양 세포의 1:2.5 비율 : 내피 세포 시드, 분석에 가장 적합합니다. 그러나 비율은 각각의 세포주 최적화 할 수 있습니다.
  4. 인큐베이터에있는 xCELLigence 시스템에 E-플레이트를 놓고 10 분 간격으로 임피던스 수치를 계속합니다.
  5. 침공은 종양 세포에 침입하여 내피 세포 접합 및 침투의 수축에 의한 세포 지수의 하락으로 다음 6-12 시간 동안 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
  6. 종양 세포를 침입의 추가 시점에 결과를 정상화. xCELLigence 소프트웨어는 시점과 결과를 정상화 허용직접 소프트웨어 창에서 볼 수 있습니다.

4. 대표 결과 :

전이성 및 비 전이성 세포에 의해 HUVEC 단층 침공의 예는 그림 3에 나와 있습니다. K7M2는 전이성 골육종 세포주이다. 이러한 세포는이 세포주 13,14의 침략적 속성을 차지하고있는 골격 링커 단백질 ezrin의 높은 수준을 표현한다. HUVEC 세포가 K7M2 세포와 도전하면 6 시간 이내에 전기 저항의 저하가있다. 전기 저항이 드롭 침입 종양 세포에 의해 HUVEC 단층의 침공을 나타냅니다. K12 셀 라인은, 다른 한편으로는, ezrin 훨씬 낮은 수준을 표현 13 결과적으로 덜 전이성이다. 세포가 준수 또는 HUVEC 단층 (그림 3)를 통해 침입 할 수없는만큼 저항을 덜 가파른 드롭 K12 세포 결과 HUVEC 단층 도전.

그림 1. 종양 세포에 의해 내피 세포의 침윤을위한 워크 플로우 프로세스의 개략도. HUVEC 세포는 젤라틴 코팅 E-접시에 도금과 합류 단층을 형성 할 수 있습니다. 단일 층을 형성하고 세포 지수는 내피 세포 단일 층의 침략으로 인해 변경으로 침공이 실시간으로 모니터링되면 악성 세포가 추가됩니다.

그림 2
그림 2. HUVEC 단층 형성. HUVEC 세포에 부착 젤라틴 코팅 금 전극에 확산으로 세포 지수의 변화. 합류 단층의 형성 18 개의 시간 후에 세포 색인의 안정화로 표시됩니다.

그림 3
그림 3. K7M2 및 K12 골육종 세포에 의해 HUVEC 세포의 침공. CEL의 가파른 감소L-지수는 높은 전이성 K7M2 세포의 도입 몇 시간 내에 발생합니다. K12 세포는 반면에, 덜 전이성하고 효율적으로 K7M2 세포와 같은 내피 세포 단일 층을 통과 할 수 없습니다. 이 HUVEC 단층은 K12 세포와 도전 셀 인덱스에서 덜 가파른 감소에 의해 표시됩니다. 컨트롤 암 세포의 부재에서 HUVEC 단층의 임피던스를 나타냅니다. 실험 세중의에서 수행 하였다.

Discussion

실시간 HUVEC의 침공 분석은 모니터링 침략을위한 간단하면서도 강력한 방법입니다. 그것은 엔드 포인트 분석에 의존하는 기존의 다른 기술에 비해 상당한 장점입니다 실시간으로 결과를 제공합니다. 분석은 시험 약물, 항체, 리간드와 전이 억제제 또는 촉진제로 단백질을 수정할 수 있습니다. 암 / 내피 세포 간 이야기에 다른 에이전트의 효과뿐만 아니라 평가 될 수있다. 이러한 문화 미디어의 성장 요인과 약물 등 외인성 에이전트를 도입 할 때, 그것은 그들이 HUVEC 단층의 무결성에 영향을주지 않도록하는 것이 중요합니다. HUVEC 단층의 파괴는 세포를 침입의 부재에서 외생 에이전트를 소개하고, 세포 지수의 변화가없는 것을 확인하여 테스트 할 수 있습니다. 따라서, 적절한 제어는 실험 설계의 일부로 포함되어야한다.

그들은 conf의 형태로 다른 세포 라인에서 여러 가지 셀 인덱스 곡선을 보여luent 단층. 곡선뿐만 아니라, 최대 셀 인덱스 달성의 형태는 셀 타입 별입니다. HUVEC 세포의 16-18 시간 후 이상 세포의 인덱스에 다른 안정화 한 다음, 4-6시간 파종 한 후 세포 색인의 평 평화 특성 과도을 보여줍니다. 따라서, 세포가 종양 세포의 추가 전에 적어도 18 시간 동안 합류 단층을 형성하게하는 것이 중요합니다.

세포 지수는 전극 / 세포 계면에서 이온 환경에 의존하기 때문에, 이러한 세포 형태와 세포 간 유착의 품질 등 다양한 요소가 적용 잘 하단의 영역뿐만 아니라, 세포 인덱스에 영향을 미친다. 따라서, 종양 세포의 침략에 발생하는 셀 인덱스의 감소, 내피 세포 접합 및 후속 종양 세포 침공의 철회를 포함 여러 가지 요인의 함수이다.

xCELLigence 악기는 세 가지 다른 구성으로 제작되어 실시간으로 세포 분석기(RTCA) SP, RTCA MP 및 RTCA DP. RTCA MP 악기는 96 - 웰 E-플레이트를 동시에 여섯까지 저장할 수있는 반면 RTCA SP 악기 하나 96 - 웰 E-플레이트를 보유하고 있습니다. 이 마약과 화합물의 높은 처리량 검사 할 수 있습니다. 이 문서에 나와있는 실험은 3 개의 16도 E-접시를 보유 할 수 있습니다 RTCA DP 악기를 사용하여 수행됩니다. 각 E-플레이트 보유 스테이션은 독립적으로 여러 사용자가 동시에 실험을 실행할 수있는 운영 할 수있다. RTCA DP 악기는 또한 CIM 플레이트를 사용하여 마이그레이션을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이들은 8um의 평균 기공 크기와 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 막으로 구분 상단 및 하단 챔버 16 - 웰 플레이트입니다. 전자 센서는 상부 챔버의 다공성 멤브레인의 아래쪽에 있습니다. 하부 챔버의 상부 챔버의 세포에 대한 화학 주성을위한 저수지 역할을합니다. 그러나 CIM 플레이트에 HUVEC 침공 분석의 주요 장점은 이전에 종양 세포 침공 전내피 세포의 침공은 종양과 내피 세포 사이의 크로스 토크에 달려들, 기공 크기에 의해 제한되지 않습니다.

HUVEC 침공 분석도 응용 생물 물리학 (트로이, NY)에 의해 제조 ECIS Z 기기에서 수행 할 수 있습니다. ECIS Z 악기 배열 전극 구성의 차이, xCELLigence 악기와 유사한 기술을 사용합니다. 우리는 성공적으로 8 잘 ECIS 배열을 사용하여 HUVEC 침공 분석을 수행했습니다. 2.5 × 10 5 1 X 10 5 세포를 각각 : 그것은 잘 바닥 면적 도금으로 내피와 종양 세포의 큰 숫자를 요구하는 ECIS 배열에있는 큰 점에 유의하는 것이 중요합니다.

Disclosures

이 논문의 출판 비용은 친절 로슈 응용 과학에 의해 제공되었다.

Acknowledgments

이 작품은 넉넉한 어린이 암 재단 (볼티모어, MD), 브랜든 리 캐링턴 재단 (실버 스프링, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137)와 NIH (R01CA108641)에서 기금에 의해 지원되었다.

우리는 박사 안톤 Wellstein과 경험을 공유하고 제시된 방법을 최적화하기 위해 우리를 돕는 그의 실험실의 구성원을 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
xCELLigence RTCA DP station Roche Group 05469759001
RTCA control unit Roche Group 05454417001 Notebook with preinstalled RTCA software
E-Plate 16 Roche Group 05469830001
HUVEC cells Lonza Inc. CC-2517
EGM-2 media Lonza Inc. CC-3156
EGM-2 bullet kit Lonza Inc. CC-4176
0.1% Gelatin in sterile H2O EMD Millipore MCPROTO045

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References

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