تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Published 7/24/2011
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Lentiviruses هي أداة بحث قيما لاستكشاف وظائف الجينات ، إلا أن الباحثين قد ترغب في تجنب إنتاج ترميز الفيروسة البطيئة شمولي التوجه المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم. كبديل ، نقدم أكثر أمانا لاستخدام بروتوكول الفيروسة البطيئة ecotropic على الخلايا البشرية المعدلة للتعبير عن mSlc7a1 مستقبلات ecotropic.

Cite this Article

Copy Citation

Barrilleaux, B., Knoepfler, P. Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety. J. Vis. Exp. (53), e2822, doi:10.3791/2822 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية دراسات غالبا ما تتطلب تنبيغ الفيروسية من الخلايا البشرية والجينات المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، ورفع القضايا الرئيسية لسلامة العاملين في المختبرات. lentiviruses شمولي التوجه ، مثل pseudotype VSV - G شيوعا ، هي أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات لأنها يمكن أن تنبيغ أنواع الخلايا عديدة ، بما في ذلك الخلايا غير الانقسام. ومع ذلك ، قد ترغب في تجنب الباحثين الإنتاج والطرد من الفيروسات المسرطنة ترميز شمولي التوجه نتيجة لارتفاع مستوى متطلبات السلامة الأحيائية المناولة وقضايا السلامة. ومن المعروف المسرطنة قوية عدة ، بما في ذلك C - Myc وSV40 المستضد T كبيرة ، لتعزيز إنتاج يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSC). كل أخرى معروفة iPSC الذي يحفز التغيرات الجينية (OCT4 ، SOX2 ، KLF4 ، NANOG ، LIN28 ، وفقدان وظيفة البروتين p53) وأيضا وصلات إلى السرطان ، مما يجعلها ذات الاهتمام سلامة عالية نسبيا أيضا.

في حين أن هذه الفيروسات المرتبطة بالسرطان مفيدة في دراسة إعادة برمجة الخلايا وتعدد القدرات ، لا بد من استخدامها بأمان. لمعالجة هذه القضايا المتعلقة بالسلامة الأحيائية ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتنبيغ الخلايا البشرية ecotropic الفيروسة البطيئة ، مع التركيز على خفض تكلفة إضافية والمناولة المريحة. أنتجنا الفيروسة البطيئة ecotropic مع عيار مرتفع بما فيه الكفاية لتنبيغ أكبر من 90 ٪ من الخلايا المستقبلة للتعبير عن الإنسان يتعرض للفيروس ، والتحقق من فعالية هذا النهج.

ويتركز أغلب الأحيان بواسطة تنبيذ فائق الفيروسة البطيئة ، ولكن هذه العملية تستغرق عدة ساعات ويمكن ان تنتج الهباء المعدية للباحثين الطب الحيوي الإنسان. كما يمكن أن يكون بديلا ، والجسيمات الفيروسية بأمان أكبر الرسوبية على الخلايا complexation مع كبريتات شوندروتن وpolybrene (CS / PB). هذا الأسلوب يزيد من عيار الفيروسية وظيفية تصل إلى أضعاف 3 في خلايا الفئران ستابلي التعبير عن مستقبلات الفيروس الارتجاعي ، مع تذكر الوقت المحتسب بدل الضائع والتكاليف. ومما يعزز من الحد الأقصى تنبيغ الخلايا الليفية الجلد البشري (HDFs) باستخدام CS / PB تركيزات ما يقرب من 4 أضعاف أقل من القيمة المثلى ذكرت سابقا لخطوط الخلايا السرطانية ، مما يوحي معاير ينبغي أن تركيز البوليمر لنوع من الخلايا المستهدفة من الفائدة. وصفنا ذلك استخدام بروميد methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium (MTT) لفحص للسمية البوليمر في نوع من الخلايا الجديدة. نلاحظ بقاء يعادل HDFs بعد تنبيغ الفيروسية باستخدام البوليمر complexation أو جرعة قياسية من polybrene (PB ، 6 ميكروغرام / مل) ، مشيرا إلى الحد الأدنى من السمية الحادة.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام الفيروسة البطيئة لecotropic overexpression من الجينات المسرطنة في الخلايا البشرية ، والحد من مخاطر السلامة البيولوجية وزيادة معدل تنبيغ. نظهر أيضا استخدام complexation البوليمر لتعزيز تنبيغ مع تجنب تشكيل الهباء الطرد المركزي من الجسيمات الفيروسية.

Discussion

ودرس المؤتلف gammaretrovirus ecotropic استنادا فيروس ابيضاض الدم الفأري مولوني (MLV) ومستقبلات mSlc7a1 لها جيدا وعلى نطاق واسع ، بعد أن استخدمت لأكثر من 20 عاما لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الفئران. كما تم استخدام أكثر gammaretrovirus Ecotropic مؤخرا لتقديم المسرطنة إلى الخلايا البشرية ؛ في سياق إعادة برمجة الخلايا ، واستخدام mSlc7a1 لتجنب توليد فيروس amphotropic بايواء المسرطنة الإنسان راسخة 4،5 ومع ذلك ، الفيروسة البطيئة يوفر مزايا هامة على gammaretrovirus transducing السكان في خلية صهر (6) ، بما في ذلك الخلايا الأولية التي غالبا ما تكون الأهداف المرغوب فيه لإعادة البرمجة ، وذلك لأن lentiviral قبل الاندماج المعقدة تسمح للخلايا تنبيغ عدم تقسيم 7

وقد تم إنتاج Lentiviruses مع العشرات من pseudotypes مختلفة ، بما في ذلك MLV ، في محاولة لتغيير tropism الفيروس ، والسمية ، وغيرها من الممتلكات. استخدمت 8 الفيروسة البطيئة ecotropic MLV - pseudotyped لتنبيغ خلايا فأر ، 9 ولكن نادرا ما كانت تستخدم على الخلايا البشرية 10 لذلك نحن نقترح استخدام MLV - pseudotyped الفيروسة البطيئة ecotropic كوسيلة آمنة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الكفاءة لتقديم المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، بما في ذلك عوامل إعادة برمجة الخلايا ، والخلايا البشرية.

فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا البروتوكول لا تقضي تماما على الحاجة إلى إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة شمولي التوجه ، بل يفصل بين هذا البروتوكول الجين الورمي (ق) من الفيروس شمولي التوجه ، وعزل باحثون من امكاناتها الذاتية التلقيح مع السرطان المرتبطة الفيروسات. وأعرب بتواجد مطلق في mSlc7a1 البروتين وhSlc7a1 لها نديد الإنسان نقل الأحماض الأمينية مع عدم وجود tumorigenicity معروفة أو القدرة على منح ميزة انتقائية على نمو خلايا المتلقي ، 11 mSlc7a1 صنع منخفضة المخاطر نسبيا لإدراجها في amphotropic الفيروس. هذه الخطوة قد تكون مفيدة بشكل خاص وأضاف في المختبرات تفتقر إلى مرافق مخصصة أو الفيروس زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية المطلوبة.

في بعض الحالات قد يكون من الممكن أن تقضي تماما على استخدام فيروس شمولي التوجه من قبل وtransfecting Slc7a1 البلازميد مباشرة إلى الخلايا المستهدفة ، إلا أن العديد من الخلايا التي من شأنها أن تكون مفيدة لأهداف هذه التقنية أيضا لصهر ترنسفكأيشن. كبديل ، والقدرة على عزل الخلايا Slc7a1 - transduced عن طريق الانتقاء blasticidin الوسائل التي يمكن استخدامها VSV - G الفيروسة البطيئة pseudotyped مرة واحدة لإنشاء مخزون من خلايا مستقبلات معربا عن بعد والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني لفيروس ecotropic تنبيغ هذه الخلايا بالنسبة لكثير التجارب. وينبغي أن تتبع دائما المبادئ التوجيهية الباحثين سلامتهم المؤسسية للعمل مع أي الفيروسة البطيئة ، بغض النظر عن tropism والخمسين.

التتر من فيروس ecotropic يتحقق مع هذا البروتوكول هي أقل نسبيا من VSV - pseudotyped الفيروس ، عادة 10-20 ٪ من عيار الفيروس شمولي التوجه ، بالاتفاق مع الدراسات السابقة. قيست 9 هذه التتر في الخلايا البشرية transduced ستابلي مع Slc7a1 ، وبالتالي فإن انخفاض وقد لاحظ لفيروس عيار ecotropic أن يعزى ذلك جزئيا إلى التعبير متنوعة من الجين في مستقبلات الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، فإن التتر الفيروسية التي تحققت في بروتوكول لدينا هي أكثر من كافية بالنسبة لمعظم التطبيقات ، وتؤدي إلى تنبيغ غالبية الخلايا ، في بعض الحالات> 90 ٪ من الخلايا.

ويشيع استخدام التقنيات المعتمدة على الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية. ويمكن استخدام ومع ذلك ، تتطلب عدة ساعات الطرد المركزي ، ويولد الهباء المعدية ، ويمكن أن يتسبب في خسائر كبيرة من الجزيئات الفيروسية (12). وكبديل ، مع complexation CS / PB لتعزيز تنبيغ دون تغيير tropism الفيروسية. 3 هذا الأسلوب السريع (5 دقائق ) وغير مكلفة (0.03 دولار للفيروس مل 10) ، في حين أن ثلاثة أمثالها تقريبا عيار ملاحظتها. وهناك حاجة إلى معدات خاصة أو الكواشف الملكية ، لاحظنا والحد الأدنى من السمية الحادة بعد التعرض للHDFs إلى CS / PB ، بالاتفاق مع الأعمال السابقة في خطوط الخلايا الأخرى. 13 عيب واحد المحتملة لهذا البروتوكول هو أن بعض مرئية المجهر مجمعات البوليمر التمسك الخلايا لعدة أيام في الثقافة. لا يمكننا استبعاد احتمال ان هذه المجمعات ، في حين لا علنا ​​السامة للخلايا ، قد يكون لها آثار أكثر مكرا على العمليات الخلوية.

هنا قد وصفنا منهجية لبأمان وكفاءة الخلايا البشرية transducing مع عوامل أنكجنيك. هذا النهج ينبغي أن تكون ذات فائدة كبيرة للباحثين الذين يدرسون الجينات المسرطنة وبيولوجيا الخلايا الجذعية بما في ذلك خلايا الجذع.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقدم التمويل لهذا المشروع من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV receptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G envelope
pCMV-dR8.91 Addgene D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-Ec–nv Addgene 15802 Ecotropic envelope
FUGW Addgene 14883 GFP control plasmid
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche Group 04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage Sigma-Aldrich C4384
Blasticidin S Fisher Scientific BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats