Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Bioengineering

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Summary

Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.

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Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164, doi:10.3791/3164 (2011).

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Abstract

Impression par microcontact fournit une méthode rapide, hautement reproductible pour la création de substrats motifs bien définis. 1 Pendant l'impression par microcontact peut être employée pour imprimer directement un grand nombre de molécules, y compris les protéines, l'ADN 2, 3 et silanes, 4 la formation de l'auto -assemblés monocouches (SAM) de longues alcane thiols sur l'or offre un moyen simple de limiter les protéines et les cellules pour des modèles spécifiques contenant des régions adhésif et résistant. Ce confinement peut être utilisé pour contrôler la morphologie cellulaire et est utile pour l'examen d'une variété de questions en protéines et en biologie cellulaire. Ici, nous décrivons une méthode générale pour la création de motifs protéiques bien définis pour les études cellulaires 5 Ce processus comprend trois étapes:. La production d'un maître à motifs en utilisant la photolithographie, impression de la création d'un timbre en PDMS, et microcontact d'un or- substrat revêtu. Une fois modelée, ces substrats de culture de cellules sont capables de confiner les protéines et / ou de cellules (cellules primaires ou de lignées cellulaires) pour le motif.

L'utilisation de la chimie monocouche auto-assemblée permet un contrôle précis sur les régions à motifs adhésifs protéines / cellules et non-adhésive régions, ce qui ne peut être réalisée à l'aide d'emboutissage directe des protéines. Hexadecanethiol, la longue chaîne alcane thiols utilisés dans l'étape d'impression par microcontact, produit une surface hydrophobe qui adsorbe facilement protéines de la solution. Le glycol terminée par un thiol, utilisés pour le remblayage des régions non-imprimées du substrat, crée une monocouche qui est résistant à l'adsorption des protéines et donc la croissance cellulaire. 6 Ces monomères thiol produisent des monocouches hautement structurés qui définissent précisément les régions du substrat qui peuvent soutenir l'adsorption des protéines et la croissance cellulaire. En conséquence, ces substrats sont utiles pour une large variété d'applications de l'étude du comportement intercellulaire 7 à la création de la microélectronique. 8

Alors que d'autres types de chimie monocouche ont été utilisés pour des études de culture de cellules, y compris les travaux de notre groupe en utilisant trichlorosilanes pour créer des motifs directement sur ​​des substrats en verre, 9 monocouches à motifs formés à partir de thiols alcane sur l'or sont simples à préparer. Par ailleurs, les monomères utilisés pour la préparation monocouche sont disponibles dans le commerce, stable, et ne nécessitent pas de stockage ou la manipulation sous atmosphère inerte. Substrats préparés à partir de thiols Patterned alcane peuvent également être recyclés et réutilisés plusieurs fois, le maintien de l'isolement cellulaire. 10

Protocol

1. Préparation du Master motifs (figure 1)

  1. Centre de la plaquette de silicium sur le spin-coucheuse et rincer la plaquette avec de l'acétone pendant l'étape initiale du programme de rotation en deux cycles dans le tableau 1. L'acétone va s'évaporer durant la deuxième étape du programme de tour en laissant un endroit propre, galette sèche.
  2. Appliquer environ 1 mL AZ9245 photorésine / en (de diamètre) à la plaquette et de spin-coat en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 1.
  3. Soft-cuire la galette résine photosensible enduit à 110 ° C pendant 2 m en utilisant une plaque chauffante de haute uniformité.
  4. Photopattern le substrat en utilisant soit un système de photolithographie écriture directe ou d'un système aligneur de masque et masque approprié. Les masques peuvent être achetés à partir d'un certain nombre de sources commerciales. En outre, les transparents imprimés avec une encre UV absorbantes, scotchée à une plate optique, peut être utilisé pour produire des modèles avec des caractéristiques importantes.
  5. Développer la plaquette à motifs 01:02 400K développeur: semi-conducteurs de l'eau déminéralisée de qualité pour 1 m 45 s avec une agitation douce. Rincez abondamment à l'eau de semi-conducteurs de qualité déminéralisée et sécher avec un flux d'azote (N 2) de gaz. Motif de développement peut être vérifiée en utilisant un microscope avec un filtre UV. Si le motif n'est pas complètement développée, la plaquette peut être retourné à la solution de développement pour le temps supplémentaire.

Note: Pour de meilleurs résultats, photopatterning doit être effectuée dans un environnement de salle blanche.

2. Préparation de PDMS Stamp (figure 2)

  1. Préparer un 10:1 en poids de résine: mélange durcisseur de Sylgard 182 (PDMS) et couvrir complètement le maître (wafer photopatterned) avec le mélange dans un plat de Pétri jetables.
  2. Dégazer le PDMS-couverte de maître dans un dessicateur sous vide jusqu'à ce qu'aucune bulle sont visibles et permettent le timbre de guérir dans un four à 65 ° C pendant 1,5 h. Avant de se guérir, il est important s'assurer que le maître est au fond du plat car il peut remonter à la surface pendant l'étape de dégazage.
  3. Couper le PDMS éradiquer du maître et de garniture à la taille appropriée. Boutique du timbre dans un récipient couvert (côté caractéristique vers le haut) pour le protéger de la poussière et les débris.

3. Préparation du substrat d'or à motifs (Figure 3)

  1. Préparer 25 mm non. Une des lamelles en verre rond pour le dépôt de métal en les traitant avec un plasma d'oxygène pour 10 m. Rincer deux fois avec de l'eau 18,2 MQ déminéralisée suivie par deux fois avec de l'éthanol, le séchage avec un courant de gaz N 2 entre chaque étape.
  2. En utilisant le système d'une poche multi-dépôt par faisceau d'électrons, dépôt de 50 Å de titane suivie par 150 pièces d'or Å. Ne pas jeter de l'évaporateur entre le dépôt de la couche de titane et la couche d'or. Alternativement, recouvert d'or lamelles peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, cependant, il est important que les couches métalliques sont préparés par évaporation par faisceau d'électrons et l'évaporation non thermique. Si acheté auprès d'une source extérieure, des substrats d'or peut être nettoyé par oxydation plasma ou "piranha" (07h03 Conc H 2 SO 4:. 30% de H 2 O 2) 11 avant de l'utiliser.

Note: "Piranha" solution est explosif en présence de composés organiques.

  1. Préparer la solution d'emboutissage, 10 mM hexadecanethiol dans l'éthanol absolu, et la solution de remblayage, de 1 mM de glycol résilié thiol dans l'éthanol absolu.
  2. Rincer le timbre à l'éthanol et sécher soigneusement avec du gaz N 2. Appliquer emboutissage solution au goutte à goutte jusqu'au timbre de PDMS entièrement enduit. Sécher le fond avec de timbre gaz N 2. Passez à 5a ou 5b, le cas échéant sur la base des caractéristiques du timbre de PDMS.
    1. Appuyez doucement sur le timbre sur le substrat d'or et de permettre la monocouche pour former pendant 15 s.
    2. Placez le substrat d'or dans une boîte de Pétri contenant de l'eau 18,2 MQ déminéralisée, assurant le substrat est immergé. Appuyez doucement sur le timbre sur le substrat d'or et de permettre la monocouche pour former pendant 15 s.
  3. Rincez le substrat estampillé fois avec de l'éthanol, le séchage à gaz N 2 après chaque rinçage et placer le substrat dans une boîte de Pétri.
  4. Couvrir le substrat avec le remblayage solution et sceller le plat avec du parafilm pour éviter l'évaporation.
  5. Autoriser la monocouche de fond à se former dans l'obscurité pour 12-14 h.
  6. Retirer la lamelle à motifs de la solution de remblayer et rincer deux fois avec de l'éthanol, le séchage à gaz N 2, après chaque rinçage.

4. Application des protéines et des cellules au substrat Patterned

  1. Placer la lamelle à motifs dans une petite boîte de Petri ou de la chambre de culture cellulaire et couvrir avec 500 ul à 1 ml de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS). Le DPBS doit couvrir complètement le substrat pendant l'incubation des protéines pour assurer une couverture en protéines, même.
  2. Ajouter une solution concentrée de protéines de la DPBS et mélanger la solution par le tuyauTing fois plusieurs années. Incuber le mélange de protéines avec le substrat à 37 ° C pendant 1 h. Les concentrations finales des laminine et la fibronectine sont typiquement 12 pg / ml et 20 pg / mL, respectivement. Les protéines peuvent être étiquetés avec un colorant fluorescent amines réactives pour permettre la visualisation modèle simple. Cependant, les protéines étiquetées doivent être mélangés avec des protéines non étiquetés 01h01 que l'étiquetage de protéines peuvent interférer avec l'activité biologique.
  3. Après incubation, laver abondamment avec le substrat DPBS (4-5x) pour éliminer les protéines non liées, en prenant soin de ne pas sécher le substrat ou l'apporter à travers l'interface air-eau. Après les trois premiers rinçages, ajouter environ 500 pi de médias complet croissance cellulaire afin de maintenir un substrat humide.
  4. Remplacez le support de croissance utilisé pour rincer le substrat avec des milieux frais.
  5. Dissocier les cellules et compter pour le placage sur le substrat. Soit cellules dissociées primaires, comme les neurones hippocampiques, ou des lignées cellulaires immortalisées, telles que cellules CHO-K1, peuvent être utilisés.
  6. Plate cellules dissociées sur le substrat. Typiquement de 30 à 200 cellules / mm 2 sont utilisés.

5. Les résultats représentatifs:

Figure 1
Figure 1. Schéma général pour la préparation de photolithographie d'un maître à motifs. Dans ce processus, une plaquette de silicium est nettoyée avec de l'acétone, enduits de résine photosensible, exposées à la structure d'intérêt, et le motif est développé.

Figure 2
Figure 2. Schématique générale pour la préparation de timbre de PDMS. Dans ce processus, le maître est couverte de motifs Sylgard (10h01 résine: durcisseur), dégazée dans un dessiccateur à vide, traité dans une étuve à 60 ° C, et coupé à la taille.

Figure 3
Figure 3. Schéma général pour la modélisation du substrat. Dans ce processus, des substrats de verre sont recouvert de titane (50A) et or (150A) à l'aide d'un évaporateur par faisceau d'électrons, modelé par hexadecanethiol impression par microcontact utilisant un timbre en PDMS, remblayé avec des thiols glycol alcane résilié, et revêtu de la protéine fluorescente-étiquetés.

Figure 4
Figure 4. Patterned maître (A) et de timbre en PDMS (B) préparés en utilisant les méthodes décrites. Barres d'échelle sont 100 microns.

Figure 5
Figure 5. SAMs Patterned visualisées avec AlexaFluor 647-étiquetés fibronectine (A) et CHO-K1 isolement cellulaire (B). Barres d'échelle sont à 100 um.

Figure 6
Figure 6. Patterned laminine ensemencé avec E18 neurones de souris hippocampe à 4 jours in vitro. AlexaFluor 350-anticorps anti-laminine anticorps est utilisé pour la visualisation motif (A) et les neurones de souris E18 hippocampe sont colorées avec Mitotracker Rouge 580 (B). Barres d'échelle sont à 100 um.

Figure 7
Figure 7. Pièges potentiels dans la préparation du substrat motifs visualisés par AlexaFluor 647-conjugué fibronectine adsorption. (A) insuffisant entraîne le mélange à la protéine inégale d'adsorption. (B) Une application inégale de la pression pendant estampage entraîne partielle Patten transfert. (C) Une pression excessive au cours d'emboutissage peut conduire à l'effondrement de timbre. (D) l'exposition de la surface de motifs à l'interface air-eau lors du rinçage peut entraîner des protéines de fond d'adsorption. Barres d'échelle sont à 100 um.

Figure 8
Figure 8. Patterning submergées peuvent produire des modèles avec des caractéristiques petites qui sont difficiles à imprimer en impression par microcontact conventionnelles dans l'air. Images (A) et (B) montrent les différentes régions du même modèle, imprimés avec le même timbre de PDMS dans l'air (A) ou de l'eau déminéralisée (B). Lignes de soutien à l'échelle 10 microns qui entourent le motif (ajouté pour aider à prévenir l'effondrement de timbre) sont considérés en (A), cependant, les caractéristiques points inférieur, comme indiqué en (B) ne sont pas vus. Cela démontre que l'impression dans l'air fonctionne bien pour les grandes fonctionnalités, mais l'impression dans l'eau peut être nécessaire pour les modèles avec de plus petites fonctionnalités. Barres d'échelle sont de 20 um.

Cycle Taux d'accélération (rpm / s) Vitesse finale (rpm) Temps (s)
1 500 1000 5
2 3800 3800 30

Tableau 1.Programme de rotation de deux cycles utilisé pour créer un revêtement épais de 4,5 um AZ9245 sur un wafer de silicium.

Pour préparer des timbres de PDMS pour la formation des motifs substrats, un master en résine photosensible est d'abord fabriquée (figures 1 et 4A). Le maître est l'inverse du cachet et est créé en utilisant soit un système de lithographie à écriture directe ou d'un aligneur de masque. Quand une résine photosensible positive, comme le AZ9245, est utilisé pour la production de maître, la plaquette résistent-enduit est exposé à la lumière avec le même motif qui apparaîtra sur le substrat final. Alors qu'il n'est pas toujours possible, il a été rapporté que le ratio d'aspect idéal (taille caractéristique de résister à l'épaisseur) pour les maîtres de timbre en PDMS est de 1:2. 13 Nous avons constaté que les ratios aspect de 01h40 sont possibles, selon la nature du motif. AZ9245 wafers de silicium revêtue dans les conditions décrites ici donnent résine photosensible avec une épaisseur nominale de 4,5 um. Nous avons trouvé que cette épaisseur de AZ9245 peut être utilisé pour produire des maîtres PDMS avec des fonctionnalités allant de> 100 um à 2 um.

Timbres de PDMS sont moulés à partir Sylgard 182 (ou Sylgard 184) à l'aide du maître fabriqués à partir de résine photosensible (figure 2). Maîtres Photoresist peut être utilisée plusieurs fois afin de créer de nombreuses copies du même timbre. Après le durcissement du PDMS, les timbres sont retirés de la maîtrise en utilisant une lame de rasoir et le cachet qui en résulte peut être visualisé sous un microscope en plaçant côté caractéristique de timbre sur une lamelle de verre (figure 4B)

Une bonne résultats estampage dans un dièse, profil protéique claires qui peuvent être visualisés par l'application de protéines marquées par fluorescence (Figures 3 et 5). Alternativement, l'immunohistochimie peut être utilisé pour visualiser le modèle de protéine après fixation cellulaire (figure 6). La croissance cellulaire est bien limitée à la structure de protéines pour les deux lignées cellulaires immortalisées et les cellules primaires (figures 5 et 6).

Bien que cette technique est facilement maîtrisé, plusieurs problèmes communs peuvent surgir. L'application de protéines sans mélange suffisant de la solution de protéines concentrées dans le DPBS peut conduire à des motifs protéiques inégale (figure 7A). Estampage incorrecte peut conduire à transfert de motif partielle ou l'effondrement de timbre (figure 7B-C). En outre, en exposant les motifs substrat contenant des protéines adsorbées à l'air peut perturber la monocouche provoquant diminution de la résistance dans le fond (figure 7D). Patterns composé de fonctionnalités très faible (<5 um) et des ratios d'aspect élevé nécessitent souvent l'utilisation de l'impression par microcontact submergé. Dans cette procédure (3.5b) de l'eau est utilisée comme une barrière pour empêcher hexadecanethiol de déposer sur le substrat en dehors du motif (figure 8). 14

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Discussion

Un certain nombre de questions peuvent surgir dans la production lithographique de maître utilisé pour la création de timbre de PDMS. Sous-exposition des résultats plaquette résister à revêtement dans les modèles flous et indistincts et la surexposition des résultats plaquette résister à revêtement en fonctionnalités élargie ou manquant. En général, les maîtres avec des tailles disposent de grandes (> 10 mm) sont relativement faciles à motif et se développer, alors que les maîtres avec de petites fonctionnalités peuvent nécessiter l'optimisation des paramètres de photopatterning vaste et le développement (au-delà des paramètres recommandés par le fabricant résine photosensible). Les maîtres les plus difficiles à produire combiner les deux fonctions, grandes et petites.

Fabrication d'un timbre en PDMS d'un maître est simple en utilisant la procédure décrite dans la section 2. Cependant, des précautions doivent être prises pour mélanger complètement les deux composantes de Sylgard 182. L'incapacité d'atteindre un mélange complet des composants se traduira par une incapacité à durcir le timbre et la destruction probable de son maître. De plus, le capitaine peut éclater quand il se séparer de la marque PDMS si la force en excès est utilisée ou une torsion se produit lors de la séparation. Si le capitaine ne pause dans le processus de retrait du timbre, il peut toujours être possible d'utiliser le timbre après le nettoyage avec de l'éthanol. Toutefois, ce timbre peut produire des modèles avec des sites de défauts.

Alors que l'impression par microcontact de la SAM à l'aide d'un timbre en PDMS est polyvalent et peut être utile dans de nombreuses applications, un certain nombre de mesures essentielles doivent être suivies pour atteindre protéines succès et l'isolement cellulaire. Pour obtenir de protéines bon et l'isolement cellulaire, des substrats d'or doit être préparé par faisceau d'électrons dépôt, car l'évaporation thermique conduit à des surfaces d'or rugueuse qui ne supportent pas la formation adéquate monocouche. Par ailleurs, nous avons constaté que la façon dont le substrat de verre est préparé pour le dépôt de titane et or affecte également la qualité du substrat d'or et de la stabilité monocouche. Alors que les substrats en verre peut être nettoyé pour le dépôt en utilisant une grande variété de techniques, y compris méthanol bouillant, «Piranha», 11 et "Buzzard" solution, 12 dans nos mains des lamelles préparées par l'oxydation du plasma sont de loin supérieure à lamelles nettoyées à l'aide d'autres méthodes. Nous avons observé que les méthodes de nettoyage au solvant, acide, et la base à base donnent monocouches avec une stabilité temporelle réduite et une augmentation du nombre de sites de défauts.

La technique de l'estampage exacte requise pour produire des protéines cellulaires et des modèles optimaux varie en fonction de la taille et la forme des caractéristiques d'être estampillé et ratio d'aspect de la marque. Généralement, la technique exacte d'emboutissage pour chaque nouveau timbre doit être optimisée et technique de l'estampage s'améliore après plusieurs essais. Appliquer trop de pression au cours d'emboutissage mènera à l'effondrement de timbre, qui est enclin à se produire avec des timbres contenant des rapports d'aspect plus (figure 7C). Sinon, l'application des résultats trop peu de pression dans le transfert de motif partielle (figure 7B). Il est également possible de profiter de la technique d'emboutissage de modifier légèrement les caractéristiques du modèle. Par exemple, nous avons constaté que les caractéristiques peuvent être légèrement augmenté en taille par estampage pour de plus longues périodes de temps et d'autres ont signalé que les dimensions de certaines fonctions peuvent être réduites en utilisant des techniques d'impression par microcontact submergée 15. Souvent les bulles d'air deviennent coincé sous le timbre lorsque effectuant emboutissage submergé; toutefois, cette technique peut donner les meilleurs résultats lors de petites caractéristiques en conjonction avec des rapports d'aspect important sont souhaitées.

Il ya plusieurs avantages à utiliser l'impression par microcontact en conjonction avec la chimie monocouche auto-assemblée. Lorsque l'impression directe des protéines sur des substrats, des changements de conformation a été démontré que surviennent 16 attribuable à l'étape où les protéines sont séchées pendant le processus d'emboutissage. Cette étape de séchage est pensé pour aboutir à l'agrégation des protéines et de dénaturation, qui à son tour affecte la fonction des protéines. Dans le système SAM, adsorber les protéines du substrat d'une solution aqueuse tamponnée, identique à la façon dont les substrats sont généralement préparés pour la culture cellulaire. De plus, l'impression par microcontact de protéines n'atteint pas l'isolement cellulaire pendant des périodes de temps prolongées, en raison du manque de molécules de protéines de fond résistant. 17 En revanche, l'utilisation d'une monocouche de fond de glycol prévoit confinement excellente. 5 Dans le cas où l'utilisation d'un substrat d'or est impossible ou indésirable, monomères trichlorosilane peut être utilisée à la place pour permettre l'isolement des protéines et des cellules. 9 Bien qu'il existe des méthodes pour le confinement des protéines et des cellules qui ne reposent pas sur l'impression par microcontact, ces méthodes ont tendance à être plus de travail intensif et ne se prêtent pas à produire le grand nombre de substrats identiques généralement requis pour des études biologiques. 18,19

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier l'ensemble du groupe Maurer à l'Université Washington, dont la connaissance collective a fait de ce protocole possible. Le financement de ce travail est fourni par le National Institute of Mental Health (1R01MH085495).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer Wafer Reclaim Services 2 inch
Spin coater/hot plate Brewer Science, Inc. Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 Photoresist Mays Chemical Company 105880034-1160
Direct-write photolithography system Microtech s.r.l. LW325 LaserWriter System
Mask Aligner HTG 3HR
AZ 400K Developer Mays Chemical Company 105880018-1160
Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
25 mm no. 1 round glass coverslips VWR international 16004-310
Plasma Oxidizer Diener Femto
Titanium piecesKamis Incorporated 99.95% pure
Gold pellets Kamis Incorporated 99.999% pure
Electron-beam evaporator Kurt J. Lesker PVD 75 Thin Film Deposition System with electron-beam accessory
Hexadecanethiol Alfa Aesar A11362
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) Sigma-Aldrich 674508
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200 200 proof, absolute
Parafilm VWR international 52858-000
DPBS VWR international 4500-434 Without calcium and magnesium
Mouse Laminin I VWR international 95036-762
Human Plasma Fibronectin Invitrogen 33016-015
AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-20006
MitoTracker Red 580 Invitrogen M22425
AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-10168
Anti-laminin antibody Fisher Scientific AB2034MI

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References

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